Fluoreszenzmikroskopie w, lichtmikroskopische Methode (Mikroskop), die sich die Eigenschaft bestimmter Stoffe zunutze macht, UV- (Ultraviolett) oder kurzwelliges sichtbares Licht (Wellenlänge λ1) zu absorbieren (Absorption) und einen Teil dieser Energie in Form einer längerwelligen Strahlung (λ2) zu emittieren (λ21: Stokessche Regel). Voraussetzungen: a) das Substrat muß fluoreszieren; b) die mikroskopische Einrichtung muß diese Fluoreszenz erkennbar machen. Dazu muß durch spezielle dichromatische Strahlteiler (Interferenzfilter) das Anregungslicht (Anregung) vom Fluoreszenzlicht separiert werden. Bei der Fluoreszenz der mikroskopischen Objekte unterscheidet man Primär- und Sekundärfluoreszenz. Beispiele für Primärfluoreszenz: Rotfluoreszenz von Chlorophyll und Porphyrinen; Grünfluoreszenz von Vitamin A1 (Retinol); gelblich-grüne Fluoreszenz von Riboflavin. Die für die Fluoreszenzmikroskopie wesentlich wichtigere Sekundärfluoreszenz ergibt sich nach Fluorochromierung des Objekts durch spezifische Fluorochrome (z.B. Acridinorange [ vgl. Abb. 1 ], Fluoresceinisothiocyanat [Fluorescein]), deren Molekülstruktur sich im allgemeinen durch folgende Charakteristika auszeichnet: Anordnung konjugierter und im Chromophor (chromophore Gruppen) koplanar liegender Doppelbindungen in Ringstruktur; Absorptionsmaximum im hinreichend langwelligen Spektralbereich, so daß die Emission im sichtbaren Licht erfolgt. Bereits extrem niedrige Farbstoffkonzentrationen – in der Hellfeldmikroskopie ohne wahrnehmbare Bildkontrasterhöhung – liefern hell leuchtende Fluoreszenzbilder und erlauben Vitalfärbungen, da dies für die lebende Zelle ohne wesentliche physiologische Belastung einhergeht. Gute Fluorochrome müssen hohe Fluoreszenzintensität bei geringem Ausbleichen und ein hohes Maß an Spezifität (selektive Anlagerung an bestimmte Biopolymere) zeigen. Als Anwendungsbeispiele der Fluoreszenzmikroskopie seien genannt: Cytodiagnostik (Früherkennung malignen Gewebes), Fluorochromierung von Ausstrichen in der Bakteriologie (z.B. Nachweis von Tuberkelbacillen durch Auramin), Nachweis von Pharmaka im Gewebe, Differenzierung lebender und toter Spermien, Chromosomenbänderungstechnik (z.B. durch Quinachrin), Immunfluoreszenz (Nachweis z.B. von Fluoresceinisothiocyanat-markierten monospezifischen Antikörpern in Zellkulturen oder Gewebeschnitten). Da heute praktisch für jedes Biomolekül ein geeignetes Fluorochrom existiert, erfährt die Fluoreszenzmikroskopie gerade in den Bio- und Medizinwissenschaften eine Renaissance. Die Fluoreszenzmikroskopie verfügt sowohl über das Potential morphologischer Untersuchungen als auch die Möglichkeit, dynamische Untersuchungen auf molekularer Ebene durchzuführen. Moderne Fluoreszenzmikroskope arbeiten prinzipiell nach zwei verschiedenen Prinzipien: sog. Wide-Field-Systeme beleuchten eine zweidimensionale Fläche und bilden diese ab, Punktmessungssysteme beleuchten einzelne Punkte und vermögen sequentiell zwei- und dreidimensionale Bilder zu generieren. Zu den aussagekräftigsten Fluoreszenztechniken zählen die Auflichtfluoreszenzmikroskopie (Epifluoreszenzmikroskopie; vgl. Abb. 2 ), bei der die Fluoreszenz auf derselben Seite nachgewiesen wird, von der aus die Anregung erfolgt, sowie die konfokale Laser-Scan-Mikroskopie, mit der Strukturen und deren Dynamik räumlich zeitlich und spektral aufgelöst werden können. Zu den neueren Entwicklungen gehören u.a. das Standing-Wave-Fluorescence-Microscope, mit dem eine höhere Auflösung erzielt werden kann, das Fluoreszenz-Korrelations-Mikroskop, das eine mikroskopische Anwendung der Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie darstellt, und das Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskop, mit dem Fluorochrome nur in einer äußerst schmalen Schicht an Grenzflächen von 2 unterschiedlichen Materialien (z.B. Zellen und Substrat) angeregt werden können und mit dem die Analyse dynamischer Vorgänge an solchen Grenzflächen möglich ist.



Fluoreszenzmikroskopie



Abb. 1: Acridinorange



Fluoreszenzmikroskopie



Abb. 2: Aufbau des Durchlicht- und Auflichtfluoreszenzmikroskops:

Als Lichtquelle dienen sehr starke Quecksilberhöchstdrucklampen, deren UV-Anteil durch ein Erregerfilter ausgeschaltet wird. Das Erregerlicht (Anregungsstrahlung) wird durch einen Kondensor hoher Apertur gebündelt auf das Objekt (Präparat) gerichtet. Ins Objektiv gelangt nun neben der Fluoreszenzstrahlung auch noch die wesentlich intensivere Erregerstrahlung, die durch ein Sperrfilter ausgeschaltet werden muß. Das Auge des Betrachters empfängt jetzt durch das Okular nur noch die Fluoreszenzstrahlung.

Neben der eben beschriebenen Durchlichtfluoreszenzmikroskopie hat sich in den letzten Jahren immer mehr die Auflichtfluoreszenzmikroskopie durchgesetzt (siehe Abb.). Dabei fungiert das verwendete Objektiv gleichzeitig als Kondensor. Als Illuminatorspiegel dient ein dichromatischer Farbteilerspiegel (Interferenzspiegel), der so konstruiert ist, daß er bei Beleuchtung unter 45° Erregerlicht von kleiner Wellenlänge (λ <420 nm) möglichst vollständig reflektiert, längerwellige anteile (λ>420 nm) und damit die Fluoreszenzstrahlung jedoch weitgehend passieren läßt. Da diese Eigenschaften in der Praxis nicht voll realisierbar sind, sind zusätzliche Erreger- und Sperrfilter notwendig. (Aus Gründen der Übersichtlichkeit ist die gestrichelte Linie [Fluoreszenzstrahlung] neben die ausgezogene Linie [Anregungsstrahlung] gezeichnet.)