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Lexikon der Biologie: RNase-Schutzexperimente

RNase-Schutzexperimente, RNase-protection analysis, eine Technik zum Nachweis und zur Analyse von Transkripten ( vgl. Abb. ).



RNase-Schutzexperimente

Der Vorteil der RNase-Schutzexperimente gegenüber der für ähnliche Fragestellungen in der Molekularbiologie angewandten S1-Kartierung liegt vor allem darin, daß die eingesetzte Sonde durch den Einsatz von RNA-Polymerasen zu einer sehr hohen spezifischen Aktivität markiert werden kann (Markierung). RNase-Schutzexperimente beruhen auf der Hybridisierung einer Sonden-RNA an isolierte RNA. Dabei wird wie folgt vorgegangen: Man kloniert einen für die jeweilige Fragestellung besonders ausgesuchten Teil desjenigen Gens, dessen Transkripte analysiert werden sollen, so hinter einen Promotor, daß für diesen Promotor spezifische RNA-Polymerasen (z.B. SP6-RNA-Polymerase bei Verwendung eines SP6-Vektors; T7-Vektoren) ein Transkript des Gen-Fragments erstellen, welches zum normalen Transkript des Gens komplementär ist, also antisense-RNA darstellt. Diese antisense-RNA wird durch eine Art run-off-Transkription erhalten, wobei verschiedene, phagencodierte RNA-Polymerasen eingesetzt werden, die mit großer Effizienz und Geschwindigkeit und hoher Spezifität für ihre jeweiligen Promotoren transkribieren können. Bei der Transkription wird eines (oder mehrere) der benötigten Ribonucleotide (Ribonucleosidmonophosphate) in markierter Form (meist radioaktiv markierte Nucleotide) eingesetzt, so daß man Markierungen hoher spezifischer Aktivität erhält. Diese Sonden-RNA wird mit zu analysierenden RNA-Präparationen hybridisiert. Hierbei bilden sich in komplementären Bereichen Hybride. Nichtkomplementäre Bereiche (mittranskribierte Restanteile des Vektors, in den das Gen-Fragment einkloniert wurde, und die transkribierten Anteile des Gens, die nicht in der Sonden-RNA enthalten sind) stehen als Einzelstränge über. Diese überstehenden Einzelstrangbereiche werden mit Hilfe von RNase A und RNase T1 (Ribonucleasen [Tab.]) hydrolysiert; es bleiben nur die gepaarten Bereiche als Doppelstrang übrig. Der markierte und durch die anhybridisierte, zu analysierende sense-RNA vor dem Verdau durch die RNasen geschützte antisense-RNA-Anteil kann nun nach denaturierender Gelelektrophorese lokalisiert, analysiert und seine Größe bestimmt werden. Man kann durch diese Experimente, je nach Wahl des klonierten Gen-Fragments und damit der Sonden-RNA, die Start- und Endpunkte von Transkripten eines Gens, aber auch die Lage von Intronen bestimmen. RNase-Schutzexperimente können aber auch dazu benutzt werden, um lediglich die Anwesenheit bestimmter Gene zu testen oder, durch quantifizierende Untersuchungen, die Menge von Transkripten zu bestimmen. Diese Experimente können dann hilfreich sein, wenn zur Analyse von Promotoren oder enhancern geeignete Reportergene nicht zur Verfügung stehen oder gebildete RNA-Transkripte nicht exprimiert werden.
Die Abb. zeigt ein Schema zum Verfahren der RNase-Schutzexperimente. Das hier dargestellte Experiment gibt im wesentlichen nur Auskunft über die Anwesenheit eines Gens. Diese Analyse kann z.B. dann durchgeführt werden, wenn Fremdgene in einen Organismus eingebracht worden sind (Transformation) und deren Aktivität in dem neuen Organismus überprüft werden soll.

E.G.

Copyright 1999 Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg

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