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Biochemie: Kontrolle der Genexpression

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Der gesamte Bauplan eines Menschen steckt prinzipiell in einer jeden Körperzelle. Dort ist das Genom in kompakter Form in den Chromosomen des Zellkerns deponiert. Die DNA-Sequenzen enthalten die Instruktionen für die Synthese von zigtausend RNAs und Proteinen. Tatsächlich realisiert ein Zelltyp aber nur einen geringen Bruchteil dieses Potenzials und unterscheidet sich dadurch von anderen Zelltypen innerhalb des Organismus. Die Expression ausgewählter Gene und die Verfügbarkeit unterschiedlicher RNAs und Proteine definieren somit die Identität einer eukaryotischen Zelle. Überlagert wird dieses basale Expressionsmuster durch die Fähigkeit von Zellen, auf chemische Signale oder wechselnde Umweltbedingungen mit einer Veränderung ihres Musters exprimierter Gene zu reagieren. Der Verlust der kontrollierten Genexpression kann zu Dedifferenzierung und maligner Entartung von Zellen führen. Angesichts dieser weit reichenden Konsequenzen haben Zellen ein striktes Kontrollsystem entwickelt, das die Genexpression auf mehreren Ebenen überwacht. Ein zentraler Ansatzpunkt dafür ist die Initiation der Transkription, die von allgemeinen und spezifischen Transkriptionsfaktoren gesteuert wird, die am oder nahe am Transkriptionsstart wirken. Hinzu kommen Genregulatoren wie Enhancer und Silencer, die weit entfernt vom Transkriptionsstart liegen. Schließlich beeinflussen Faktoren wie die Besetzung von Promotorregionen mit Histonen oder spezifische DNA-Methylierungsmuster die Effizienz der Transkription nachhaltig.

20.1 Ein Komplex aus allgemeinen Transkriptionsfaktoren platziert die RNA-Polymerase

Bakterien verfügen über einfache, aber effektive Mechanismen zur Genregulation. Klassische Beispiele dafür sind das lac-Operon sowie das trp-Operon, deren molekulare Mechanismen in großen Zügen verstanden sind. Dagegen erfordert die regulierte Genexpression in Eukaryoten sowohl den Aufbau von Komplexen aus allgemeinen Transkriptionsfaktoren, die direkt mit dem Promotor interagieren, als auch die Bindung von spezifischen Transkriptionsfaktoren, die mit meist stromaufwärts vom Transkriptionsstart gelegenen regulatorischen Sequenzen interagieren. Promotoren integrieren das Zusammenspiel dieser Genregulatoren mit Signalen aus anderen Bereichen der DNA und entscheiden dann, ob eine Transkription von proteincodierenden Genen durch RNA-Polymerase II gestartet wird oder nicht.

Welche Merkmale zeichnen das Herzstück dieses Regelwerks – den Promotor – in eukaryotischen Genen aus? Ähnlich wie bei Prokaryoten findet man in vielen eukaryotischen Promotoren eine TATA-Box; allerdings liegt sie bei ca. –30 bp und damit etwas weiter stromaufwärts der Transkriptionsinitiationsstelle als bei Prokaryoten (Abbildung 20.1, in dieser Leseprobe nicht enthalten). Weitere Merkmale sind pyrimidinreiche Initiator-Elemente (Inr-Elemente) nahe der Transkriptionsstartstelle sowie eine variable Anzahl von CCAAT-Boxen bzw. GC-Boxen weiter stromaufwärts. Vorkommen und Häufigkeit dieser Elemente sind charakteristisch für den Gentyp: So enthalten z.B. »Haushaltsgene« (engl. housekeeping genes), die für fundamentale Stoffwechselenzyme codieren und in allen Zelltypen transkribiert werden, sehr viele GC-Boxen, aber keine TATA- und meist auch keine CCAAT-Box.

Eukaryotische Promotoren sind im Grundzustand in der Regel stumm. Erst durch die Assemblierung von allgemeinen Transkriptionsfaktoren (TF) entsteht eine Plattform für RNA- Polymerase II, von der aus sie die Transkription von proteincodierenden Genen aufnimmt. Zuerst bindet TFIID, ein Komplex aus einem TATA-bindenden Protein (TBP) und mehreren TBP-assoziierten Faktoren (TAF), an die TATA-Box (Abbildung 20.2, in dieser Leseprobe nicht enthalten). Dabei legt sich die symmetrisch gebaute Untereinheit TBP wie ein Sattel um die DNA. Auf dem TBP-Sattel docken nun die TAFs an: Nach Rekrutierung der beiden Faktoren TFIIA und TFIIB kann nun RNA-Polymerase II zusammen mit TFII-F an den Initiationskomplex binden. Das Enzym dockt dabei mit seiner carboxyterminalen Domäne direkt an die zentrale TFIID-Einheit an (Abschnitt 17.4). Schließlich bindet TFIIH mithilfe von TFIIE an den Multiproteinkomplex. TFIIH ist eine ATP-abhängige Proteinkinase, die die RNA-Polymerase an Serin- und Threoninresten ihrer C-terminalen Domäne (CTD) phosphoryliert (Abschnitt 17.4) und damit aus dem Initiationskomplex entlässt. Gleichzeitig entwindet TFIIH mit einer assoziierten Helikaseaktivität unter ATP-Verbrauch die DNA: Damit ist der Startschuss für die Transkription gefallen!

Neben den allgemeinen Transkriptionsfaktoren vom TFII- Typ, die an praktisch allen proteincodierenden Genen arbeiten, gibt es auch spezifische Transkriptionsfaktoren, die selektiv ein Gen oder eine Gengruppe regulieren. Diese Genregulatoren umfassen eine außerordentlich vielfältige Gruppe von Proteinen, die an unterschiedliche Regulatorsequenzen am oder auch in einiger Entfernung vom Promotor binden; sie ermöglichen damit Zellen eine gezielte Steuerung ihrer Expressionsmuster. Als Aktivatoren oder Repressoren binden sie an regulatorische Sequenzen und interagieren mit der Transkriptionsmaschinerie via TAF (Abbildung 20.3, in dieser Leseprobe nicht enthalten). Anders als ihre bakteriellen Pendants konkurrieren die eukaryotischen Repressoren aber nicht direkt mit der RNA-Polymerase um die DNA-Bindung: Sie greifen vielmehr regulierend in Rekrutierung und Organisation des Initiationskomplexes ein und bestimmen dadurch wesentlich die Transkriptionsfrequenz.

20.2 Spezifische Transkriptionsfaktoren binden an definierte DNA-Segmente

Wie kann eine eukaryotische Zelle unter Zigtausenden von Genen genau diejenigen aktivieren, deren Produkte sie benötigt? Die Aktivierung hat zwei Voraussetzungen: Zum einen müssen definierte DNA-Sequenzen ausgewählte spezifische Transkriptionsfaktoren binden; zum anderen müssen diese Genregulatoren mit dem Initiationskomplex interagieren. Auf der Seite der DNA sind es die Nucleotide in den kleinen und großen Furchen, die mit DNAbindenden Proteinen interagieren, ohne dass hierbei die Basenpaarung innerhalb der Doppelhelix aufgehoben würde (Abbildung 20.4, in dieser Leseprobe nicht enthalten). Jedes Basenpaar hat ein charakteristisches Muster von Donor- und Akzeptorgruppen, die Wasserstoffbrücken oder hydrophobe Interaktionen mit Transkriptionsfaktoren eingehen können. Zucker- oder Phosphatgruppen der DNA, an die z.B. Histone binden, sind wegen ihrer Uniformität für solche sequenzspezifischen Erkennungsprozesse nicht geeignet.

Typische DNA-Sequenzen, die von spezifischen Transkriptionsfaktoren erkannt werden, sind ca. 6–20 Nucleotide lang. Trotz dieser begrenzten Länge binden diese Proteine spezifisch und fest an ihre DNA-Zielsequenzen: Multiple, an sich schwache Einzelbindungen führen zusammen zu einer stabilen Wechselwirkung. Typischerweise docken die Transkriptionsfaktoren über eine Erkennungshelix an ihre spezifische DNA-Sequenz an (Abbildung 20.5, in dieser Leseprobe nicht enthalten). Die spezifischen Transkriptionsfaktoren liegen meist als Dimere vor; die Symmetrie der Bindungsproteine spiegelt oftmals die Symmetrie ihrer DNA-Zielsequenzen wider (Abschnitt 20.3).

Eine relativ heterogene Gruppe von Proteinen dient als spezifische Transkriptionsfaktoren. Nach der Natur der Sekundärstrukturelemente, die an DNA-Erkennung und DNA- Bindung beteiligt sind, bezeichnen wir sie als Helix-loop-He- lix-(HLH-) Proteine, Helix-turn-Helix-(HTH-) Proteine, Zinkfingerproteine bzw. leucine-zipper-Proteine. Die Analyse des menschlichen Genoms hat gezeigt, dass ca. 6% aller Gene, die in mRNA transkribiert werden, für allgemeine oder spezifische Transkriptionsfaktoren codieren und dabei mindestens 1800 unterschiedliche Faktoren erzeugen. Das menschliche Genom verwendet also einen nicht unerheblichen Teil seiner Information auf die Feinsteuerung seiner eigenen Expression – wir werden dem Phänomen extensiver Regulation noch häufiger begegnen. Bei der Suche nach den DNA-Zielsequenzen von Transkriptionsfaktoren ist der EMSA-Test (engl. electrophoretic mobility shift assay) oft zielführend (Exkurs 20.1).

Exkurs 20.1: Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA)

DNA-Moleküle werden im elektrischen Feld nach ihrer Größe aufgetrennt. Bindet ein Protein wie z.B. ein Transkriptionsfaktor an eine definierte DNA-Sequenz, so ist der resultierende DNA-Protein-Komplex größer als die »nackte« DNA. Je nach Größe und Ladung des assoziierten Proteins kommt es daher zu einer mehr oder minder verzögerten Wanderung der DNA im elektrischen Feld. Im Experiment wird ein radioaktiv markiertes DNA-Fragment mit einem potenziellen Bindungsprotein inkubiert und einer Gelelektrophorese unterzogen; als Vergleich dient die proteinfreie DNA. Im Autoradiogramm rufen geringste Mengen eines spezifischen DNA-bindenden Proteins eine charakteristische Verschiebung der DNA-Bande (engl. shift) hervor. Bei der gezielten Suche nach Bindungspartnern innerhalb eines Proteingemischs werden als Sonden häufig synthetische, 32P-markierte Oligonucleotide eingesetzt. Alternativ kann man biotinylierte Proteine verwenden, die mittels sensitiver Lumineszenzverfahren nachgewiesen werden (Exkurs 6.4).

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