Lexikon der Biologie

Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie



Mit dem FCS-Verfahren kann z.B. der Ca2+-Gehalt von Zellen mit höchster Präzision ermittelt werden. Verwendet wird dazu der Fluoreszenzfarbstoff Fura-2. Dieser Farbstoff arbeitet sowohl in Absorption als auch in Emission mit zwei Wellenlängen. Der freie, ungebundene Farbstoff hat sein Emissionsmaximum bei 518 nm, der im Calciumkomplex gebundene bei 510 nm. Das Absorptionsmaximum liegt für freies Fura-2 bei 362 nm, für komplex gebundenes bei 335 nm. Die Farbstoffe Fura-1, Fura-3 und andere stellen zwar aufgrund ihres größeren Abstands der Emissionswellenlängen im gebundenen und ungebundenen Zustand keine so hohen Anforderungen an die Schmalbandigkeit des Detektors, haben dafür aber eine deutlich geringere Quantenausbeute. Will man markierte Partikel innerhalb einer Zelle nachweisen, so wird die Intensität des ausgesandten Fluoreszenzlichts nicht nur von der Konzentration des markierten Stoffs, sondern auch durch Strukturelemente der Zelle (z.B. optische Zelldichte) sowie durch optische Fehler des Mikroskops beeinflußt. Einige der Fluoreszenzmarker zum Nachweis von Ca2+ (u.a. Fura-2) zeigen ein derart günstiges optisches Verhalten, daß solche Meßfehler korrigiert werden können. Beobachtet man die Intensität des Fluoreszenzlichts bei einer Emissionswellenlänge von 510 nm (Emissionsmaximum des komplex gebundenen Farbstoffs), so hat dieser Wert bei einer Anregungswellenlänge (Absorption des Farbstoffs) von 340 nm einen für alle Calciumkonzentrationen konstanten Wert. Messungen der Fluoreszenzstrahlung ergeben bei dieser Wellenlänge Werte, die nur von den Strukturelementen der Zelle und durch das verwendete Mikroskop bestimmt sind. Außerhalb dieser Anregungswellenlänge zeigt die Fluoreszenzintensität eine deutliche Konzentrationsabhängigkeit. Wird der calciumabhängige Wert durch den calciumunabhängigen Wert dividiert, erhält man den Calciumgehalt mit höchster Präzision.

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