Lexikon der Biologie

Gentechnologie



Molekulargenetische Methoden



Voraussetzung für die während der 1970er Jahre einsetzenden raschen Fortschritte der Gentechnologie war vor allem die Entwicklung bzw. Verfeinerung der folgenden molekulargenetischen Methoden:

1) Die Möglichkeit zur Spaltung von DNA mit Hilfe von Restriktionsenzymen außerhalb der lebenden Zelle. Dies ist eine unabdingbare Voraussetzung zur Isolierung definierter DNA-Fragmente, zur Vorbereitung von „Fremd-DNA“ sowie Vektor-DNA (Vektoren) für die Klonierung als auch zur Feinstrukturuntersuchung (Mapping, Restriktionsanalyse, RFLP, Sequenzanalyse) von DNA.

2) Die Ligation von Fremd-DNA-Fragmenten, welche die zu klonierenden intakten Gene, Genteilbereiche bzw. genetisch wirksame Signalstrukturen enthalten, in die geöffnete Lücke einer Vektor-DNA. Das Produkt dieser von der DNA-Ligase katalysierten Reaktion ist eine DNA, die sich aus 2 ursprünglich nicht verbundenen, in der Regel sogar aus verschiedenen Organismen stammenden DNA-Stücken zusammensetzt (sog. chimäre DNA; rekombinante DNA); die Ligation stellt daher den eigentlichen Schritt der in-vitro-Gen- bzw. DNA-Neukombination dar.

3) Techniken zur Einschleusung isolierter DNA in lebende Empfängerzellen. Ein großer Teil der heute angewandten Verfahren geht im Prinzip auf die schon in den 1940er Jahren entwickelte bakterielle Transformation mit „nackter“ DNA zurück. Für die routinemäßige Anwendung der Transformationstechnik in der Gentechnologie war die systematische Erweiterung auf DNAs von mikrobiellen Plasmiden, Viren und Bakteriophagen sowie die Konstruktion davon abgeleiteter Vektoren wie Cosmiden, Phagemiden oder YACs (Hefevektoren) ausschlaggebend. Bei Zellen vor allem Zweikeimblättriger Pflanzen hat sich das Ti-Plasmid des Bodenbakteriums Agrobacterium tumefaciens als Vektor gut bewährt. Bei Insekten werden transponierbare Elemente wie z.B. P-Element bei Drosophila melanogaster oder Baculoviren verwendet, bei Säugern kommt meist virale DNA (z.B. von SV40 [Polyomaviren], Vacciniaviren [Pockenviren] und Retroviren) zum Einsatz. Das Einbringen von antisense-Genen findet in der Pflanzenzucht Anwendung, im Rahmen der antisense-Therapie werden antisense-DNAs oder antisense-RNAs in Zellen eingebracht, ermöglichen aber keine stabile Transformation. Zur Einschleusung von DNA in Einzelzellen (bzw. deren Zellkerne) menschlicher und tierischer Zellkulturen (jedoch nicht in Einzelzellen differenzierter Organismen) sowie in die Zellkerne befruchteter Säuger-Eier (z.B. von Mäusen) eignet sich die Mikroinjektion. Das Verfahren hat den Vorteil, daß die einzuschleusende DNA beliebig in freier Form oder lediglich an ein bakterielles Plasmid, nicht aber an die zur Transformation tierischer Zellen sonst erforderliche virale DNA gekoppelt, eingesetzt werden kann. Für die Genmanipulation von Säugern eignet sich außerdem die retrovirale Infektion sowie der DNA-Transfer in embryonale Stammzellen. Weitere Techniken der Transformation bzw. Transfektion sind das Einbringen von DNA in Zellen mittels Calciumphosphat und Polyethylenglykol (z.B. zur Transfektion pflanzlicher Protoplasten), die Elektroporation, bei der die Plasmamembran mittels kurzer elektrischer Impulse permeabel gemacht wird, oder das Mikroprojektil-Bombardement, bei dem mikroskopisch kleine Partikel, an die DNA gebunden ist, in Zellen „hineingeschossen“ werden (biolistische Methode, Partikelkanone).

4) Die Selektion transformierter Zellen. Mit der Einführung von Resistenzgenen gegen Antibiotika (Resistenzfaktoren, Antibiotika-Resistenz) und anderer genetischer Selektionsmarker (Selektion) auf den Vektor-DNAs wurde es möglich, transformierte Zellen und damit indirekt die in den Vektoren enthaltene Fremd-DNA gegenüber den in großer Überzahl verbleibenden, nichttransformierten sensitiven Zellen zu unterscheiden und selektiv abzutrennen. Die Entwicklung alternativer, Antibiotika-unabhängiger Selektionssysteme, vor allem beim Einsatz gentechnischer Methoden in der Nahrungsmittelproduktion (food design) und zur Gewinnung transgener Pflanzen (z.B. selektives Wachstum auf Mannose), wird inzwischen forciert vorangetrieben.

5) Die Vermehrung der in vitro rekombinierten Gene bzw. DNA-Fragmente in lebenden Empfängerzellen. Dies ist möglich, wenn die Fremd-DNA in der Empfängerzelle und deren Nachkommen in Form eines freien Plasmids weiterexistiert oder wenn sie, wie es bei mikroinjizierter DNA die Regel ist, durch rekombinatorische Folgeprozesse kovalent in chromosomale DNA (Chromosomen) integriert wird. Da die Vermehrung der Empfängerzellen asexuell (durch asexuelle Fortpflanzung) erfolgt, deren Nachkommen also einen genetisch einheitlichen Klon darstellen, werden die Kombination aus selektiver Restriktion und Ligation von Fremd-DNA, deren Einschleusen in Empfängerzellen und deren Vermehrung in Form von Klonen als DNA-Klonierung (häufig auch abgekürzt Klonierung) bezeichnet.

6) Klonieren von ganzen Genomen bzw. von mRNA-komplementären cDNAs. Das gesamte Genom eines Organismus bzw. eine mRNA-Population, die in eine cDNA revers transkribiert wird (reverse Transkription), kann in geeignete Vektoren kloniert werden und steht damit als sog. Genbibliothek zur Verfügung. Daraus können gezielt DNA-Fragmente (genomische Bibliothek) bzw. cDNAs (cDNA-Bibliothek) isoliert werden. Im letzteren Falle werden die cDNAs oftmals in Expressionsvektoren kloniert, die eine in-vivo-Expression (Expressionsbibliothek, in vivo expression technology) der klonierten cDNAs gestatten.

7) Verfeinerung der Methoden der molekularen Hybridisierung zum Nachweis und zur Isolierung von DNA in komplexen DNA-Fragmentgemischen bzw. zur spezifischen Selektion (Screening) einzelner Klone aus der Vielzahl von Klonen einer Genbibliothek.

8) Methoden zur Sequenzanalyse von Nucleinsäuren (Desoxyribonucleinsäuren, Ribonucleinsäuren). Die Sequenzanalyse von DNA als Methode zur Feinstrukturermittlung von Genen und Signalstrukturen zusammen mit der Kartierung von Restriktionsstellen auf der betreffenden DNA eröffnet die Möglichkeit zur Auswahl exakt definierter Fragmente und Subfragmente von gleichsam „maßgeschneiderter“ Länge für weitere Klonierungsschritte oder für funktionelle Untersuchungen (Restriktionsanalyse, Mapping). Im Rahmen des Genomprojekts wurden Techniken zur Sequenzanalyse verstärkt automatisiert (DNA-Sequenzer) und die Verarbeitung der gewonnenen Daten durch Einsatz der Bioinformatik in ihrer Effizienz enorm gesteigert.

9) Gezielte Veränderung der Basenabfolge eines DNA-Moleküls. Hierfür wird vor allem die in-vitro-Mutagenese angewandt, durch die kleinere Teilbereiche einer DNA in einem Ansatz gezielt verändert werden können. Größere Bereiche können mittels homologer Rekombination, meist in Kombination mit spezifischen Genschaltern (z.B. das Cre-loxP-System), verändert werden.

10) Methode zur organisch-chemischen und enzymatischen Synthese von Genen (Gensynthese) und genetisch wirksamen Signalstrukturen. Diese Methoden sind außer für die Neusynthese besonders für die in-vitro-Mutagenese von zunehmender Bedeutung.

11) In-vitro-Vermehrung von DNA-Fragmenten mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR).

12) In-vitro-Testsysteme für die Untersuchung von Genkonstrukten (Fusionsgene). Hierzu wurden die in-vitro-Transkription, in-vitro-Spleißsysteme, in-vitro-Translationssysteme und Expressionssysteme entwickelt, die auf relativ einfache Weise erlauben, Reaktionsmechanismen, die beteiligten Komponenten sowie Funktion und Struktur der rekombinanten Proteine zu analysieren.

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