Lexikon der Biologie



indirekte Endmarkierung



Verwendung der indirekten Endmarkierung bei der Suche nach DNase I-hypersensitiven Stellen. Soll die DNase I-Hypersensitivität des Chromatins oberhalb eines bekannten DNA-Abschnitts, z.B. oberhalb der Initiationsstelle der Transkription eines Gens, untersucht werden, wird natives Chromatin mit DNase I inkubiert; danach werden die Nucleosomen abgelöst und die so gereinigte genomische DNA im folgenden mit einem Restriktionsenzym nachgeschnitten, dessen Schnittstelle auch dasjenige Fragment auf einer Seite begrenzt, welches direkt markiert und als Hybridisierungsprobe zur indirekten Endmarkierung der gesuchten Fragmente eingesetzt werden soll. Die durch DNase I und Restriktionsenzym verdaute (Verdau) genomische DNA wird nach Auftrennung durch Gelelektrophorese auf eine Membran geblottet (blotting-Techniken) und mit der markierten Sonde hybridisiert (Hybridisierung). Dieses direkt markierte Fragment macht auf der Membran alle diejenigen DNA-Fragmente erkennbar, die durch Schnitte der DNase I und des Restriktionsenzyms begrenzt und in einem (End-)Bereich komplementär zur eingesetzten Sonde sind. Nach Bestimmung der Größe der indirekt markierten Fragmente auf der Membran kann der Ort der DNase I-Hypersensitivität ausgehend von der der Sonde und der genomischen DNA gemeinsamen Restriktionsschnittstelle bestimmt werden.

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