Lexikon der Biologie

in-situ-Hybridisierung



Der Vorteil nichtradioaktiver Methoden besteht nicht nur darin, daß Radioaktivität vermieden wird, sondern auch in einer schnelleren Durchführung, da die Autoradiographie oft viele Wochen benötigt. Hierbei werden bei der Synthese der Sonden an Biotin oder Digoxigenin gekoppelte Nucleotide verwendet. Diese veränderten Nucleotide können dann mit einem primären Antikörper gegen Biotin oder Digoxigenin nachgewiesen werden. Dazu wird ein gegen den primären Antikörper gerichteter sekundärer Antikörper eingesetzt, der an ein Enzym gekoppelt ist, das über eine entsprechende Farbreaktion sichtbar gemacht wird. Bei der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) trägt der Antikörper dagegen ein Fluorochrom, z.B. Fluoresceinisothiocyanat (FITC; Fluorescein) oder Rhodamin. Damit läßt sich nicht nur eine Signalverstärkung erzielen, sondern es lassen sich auch mehrere, verschieden markierte Sonden gleichzeitig einsetzen (Vielfarben-FISH). Die FISH eignet sich u.a. zur physikalischen Kartierung von Genen und genomischen Markern an Metaphasechromosomen, nach Präparation dekondensierter DNA bzw. Chromatinfasern zur Feinkartierung von Genen (Fiber-FISH), und spielt inzwischen eine wichtige Rolle bei der pränatalen Diagnostik, weil damit Chromosomenanomalien schnell nachweisbar sind. Die Empfindlichkeit der FISH-Methode liegt erheblich höher als bei der radioaktiven Markierung und konnte vor kurzem so gesteigert werden, daß inzwischen sogar einzelne mRNA-Moleküle nachweisbar sind. Werden verschieden fluoreszierende Sonden für die verschiedenen Regionen eines mRNA-Moleküls verwendet, läßt sich sogar die Kinetik der Transkription einzelner mRNA-Moleküle durch Messung der Fluoreszenzverhältnisse bestimmen.

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