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Lexikon der Biochemie: Hybridisierung

Hybridisierung, Bildung einer Hybrid-Nucleinsäureduplex durch die Assoziation von Einzelsträngen der DNA und der RNA (DNA:RNA-Hybrid) oder von Einzelsträngen der DNA, die in einer natürlichen Duplex nicht aneinandergebunden sind (DNA:DNA-Hybrid). Es sind auch RNA:RNA-Hybride möglich. Die Hybridisierung dient dazu, spezifische Nucleotidsequenzen zu erkennen und zu isolieren und das Ausmaß der Homologie zwischen Nucleinsäuren zu bestimmen. Hierzu werden die beiden Nucleinsäuren durch Erwärmen über den Tm (Schmelzpunkt) hinaus denaturiert und anschließend eine Hybridisierung bei einer Temperatur, die 25°C unterhalb der Tm liegt, ermöglicht . Einzelstränge müssen ebenfalls durch Erwärmen denaturiert werden, damit Basenpaarungen innerhalb des Strangs aufgebrochen werden. Normalerweise liegt eine Komponente (RNA oder cDNA) der Hybridisierungsmischung in relativ niedriger Konzentration vor und ist radioaktiv (mit bekannter spezifischer Radioaktivität) markiert mit 32P oder 3H, während die andere Komponente (zelluläre DNA oder Fragmente davon) unmarkiert und im Überschuss vorhanden ist. Die H. wird bestimmt, indem die einzelsträngigen von den doppelsträngigen Nucleinsäuren getrennt werden und die spezifische Radioaktivität der doppelsträngigen gemessen wird.
Zur Quantifizierung der Hybridisierung wird meistens die Filter- oder Geltechnik eingesetzt. Die DNA wird denaturiert und auf einem Agarose- oder Polyacrylamidgel aufgetrennt oder an einen Cellulosenitratfilter adsorbiert. Das Gel oder der Cellulosenitratfilter werden nun mit einer Lösung der radioaktiv markierten DNA oder RNA, die nachgewiesen werden soll, inkubiert. Das ungebundene radioaktive Material wird durch Verdauung mit Hilfe von Ribonuclease (DNA:RNA-Hybride sind gegen Enzyme resistent) oder einer Desoxyribonuclease, die bevorzugt einsträngige DNA angreift, entfernt. Die Menge an Radioaktivität, die nach dem Waschen auf dem Gel oder dem Filter verbleibt, ist ein Maß für die Komplementarität zwischen den Sequenzen der beiden Proben.
Eine Hybridisierung kann auch in Lösung durchgeführt werden. In diesem Fall werden die einzel- und doppelsträngigen Verbindungen durch Chromatographie auf Hydroxyapatit getrennt.
 DNA:RNA-Hybride. Die Hybridisierung von RNA mit DNA kann zur Untersuchung der Genmultiplizität und zur Genisolierung genutzt werden. Bei der cytologischen Hybridisierung lässt man radioaktive RNA mit chromosomaler DNA eines histologischen Präparats hybridisieren. Dadurch erhält man Hinweise auf den Chromosomenort des Gens (der Gene) der betreffenden RNA. Umgekehrt können klonierte DNA-Gensonden dazu verwendet werden, die histologische Verteilung der mRNA aufzuzeigen, die dem klonierten Gen entspricht.
 DNA:DNA-Hybride. Wenn hitzedenaturierte DNA (Schmelzpunkt) langsam abgekühlt wird, können sich wieder Doppelstrangmoleküle ausbilden, d. h. die Einzelstränge reassoziieren. Wenn zwei verschiedene DNAs gemeinsam denaturiert werden, wird das reassoziierte Gemisch Hybridmoleküle enthalten, vorausgesetzt die beiden DNAs besitzen gemeinsame Basensequenzen. Auch mit Hilfe von DNA:DNA-Hybridisierung kann die Kopienzahl von Genen ermittelt werden. Die DNA:DNA-Hybridisierung in Lösung, mit anschließender Bestimmung der Tm des resultierenden Hybrids, stellt in der biochemischen Taxonomie ein leistungsstarkes Hilfsmittel dar. Die Differenz der Tm (ΔTm) zwischen konspezifischen (gleiche Arten) und heterospezifischen (verschiedene Arten) DNA-Hybriden ist ein Maß für die evolutionäre Nähe der beiden Organismen.
 Hybridisierungskinetik. Die Assoziation zweier Stränge folgt einer Kinetik zweiter Ordnung. Das Gleichgewicht lautet: A + B

AB, wobei AB dem Hybrid oder dem reassoziierten Molekül entspricht. Wenn a und b die Ausgangskonzentrationen der beiden Stränge A und B sind und x die Konzentration von AB zur Zeit t, dann ist die Geschwindigkeit der Assoziation gegeben durch: dx/dt = K1·(ax)·(bx) – K2·x. Da K2 viel kleiner als K1 ist, folgt näherungsweise: dx/dt=K1·(ax)·(bx). Obwohl ein Hybridisierungspartner oft in relativ niedriger Konzentration vorliegt (d. h. a>>b), gibt es Umstände, unter denen A und B in gleicher Konzentration vorhanden sind, z. B. bei der Reassoziation geschmolzener DNA oder bei der Hybridisierung gleicher DNA-Mengen aus verschiedenen Spezies. Die obige Gleichung lautet dann: dx/dt = K1(ax)2 und die Integration ergibt: x/a = a·K1·t/(1 + K1·a·t). Diese Gleichung stellt die mathematische Grundlage der Cot-Methode (Cot) dar und wird gewöhnlich ausgedrückt in C/Co = 1/(1 + K·Co·t), wobei C = Konzentration der restlichen DNA (mol/l) zur Zeit t [Sekunden] und Co = Anfangskonzentration denaturierter DNA (mol/l) ist. Die graphische Darstellung der Hybridisierung bzw. Assoziation erfolgt durch das Auftragen von Co·t gegen C/Co (Abb.). Da die beobachteten Geschwindigkeitsbereiche sich um mindestens acht Größenordnungen unterscheiden, ist es notwendig, Cot in logarithmischem Maßstab aufzutragen; die resultierende Kurve zweiter Ordnung ist gewöhnlich symmetrisch.



Hybridisierung. Hybridisierungsdiagramme bzw. "C0t-Kurven" verschiedener DNA-Proben. 1) Poly U + poly A; 2) Maus-Satelliten-DNA; 3) Phagen-T4-DNA; 4) Rhizobium-DNA; 5) Überschuss Sojabohnen-DNA mit radioaktiver Wurzelknöllchen-Leghämoglobin-cDNA [Einzel- und Doppelstrang-DNA auf Hydroxyapatit getrennt und Radioaktivität der Doppelstrang-DNA als Index für die Fraktion (C/C0) von aneinandergelagerter cDNA angezeigt].

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