Nucleasen, zu den Hydrolasen gehörende Gruppe von Enzymen, die Nucleinsäuren spalten. Man unterscheidet je nach Angriffsart der N. Exonucleasen, die das Nucleinsäuremolekül vom Ende her abbauen, und Endonucleasen, die eine Spaltung innerhalb der Polynucleotidkette herbeiführen. Die spezifisch Desoxyribonucleinsäuren spaltenden N. werden Desoxyribonucleasen (DNasen), die Ribonucleinsäuren spaltenden Enzyme Ribonucleasen (RNasen) genannt. Alle N. sind Phosphodiesterasen, da sie die Hydrolyse entweder der 3'- oder der 5'-Bindung der 3',5'-Phosphodiesterbindung katalysieren. Der wichtigste Vertreter der N. ist die Ribonuclease.

Nucleosidasen spalten im Unterschied zu den N. die N-Glycosidbindung von Nucleinsäuren.