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Lexikon der Biochemie: Nucleinsäuresequenzierung

Nucleinsäuresequenzierung, Bestimmung der Nucleotidanordnung in einer Nucleinsäure oder einem Polynucleotidsegment, d.h. Bestimmung der Primärstruktur. Es ist möglich, sowohl RNA als auch DNA zu sequenzieren, jedoch werden die meisten gegenwärtigen Analysen an der DNA ausgeführt. Die ersten biologisch wichtigen Nucleinsäuren, die sequenziert wurden, waren kleine RNA-Moleküle, transfer-RNA und ribosomale 5S-RNA. Das Verfahren begann mit der Spaltung der RNA in kurze Fragmente mittels partieller Verdauung durch Endonucleasen. Diese Fragmente wurden getrennt und anschließend durch partielle Verdauung mit einer oder zwei Nucleasen sequenziert. 1) Schlangengiftdiesterase spaltet den terminalen Nucleotidrest schrittweise vom 3'-Ende ab, unter Bildung von 5'-Mononucleotiden und einer Mischung aus (n-1)-, (n-2)-, usw. Oligonucleotiden. 2) Milzdiesterase spaltet schrittweise den terminalen Nucleotidrest vom 5'-Ende ab, wobei 3'-Mononucleotide und eine Mischung aus (n-1)-, (n-2)-, usw. Oligonucleotiden gebildet werden. Diese Oligonucleotidgemische wurden chromatographisch oder elektrophoretisch aufgetrennt, die Basenzusammensetzung jeder Komponente wurde bestimmt. Durch Vergleich der Basenzusammensetzung von Komponentenpaaren, die sich in ihrer Länge durch ein Nucleotid unterscheiden (abgeleitet aus ihrer relativen chromatographischen oder elektrophoretischen Beweglichkeit), wurde die Identität des 3'- oder 5'-terminalen Nucleotids (abhängig von der eingesetzten Exonuclease) der größeren Komponente bestimmt. Wenn dies mit allen möglichen Oligonucleotidpaaren durchgeführt wird, erhält man die Nucleotidsequenz des RNA-Fragments, von dem sie abstammen. Wenn diese Information für alle RNA-Fragmente, die durch Endonucleaseaktivität erhalten werden, verfügbar ist, kann über die Suche nach überlappenden Sequenzen die gesamte Nucleotidsequenz der ursprünglichen RNA bestimmt werden.

1977 wurden zwei Methoden zur DNA-Sequenzierung veröffentlicht, die – in Verbindung mit der zunehmenden Verfügbarkeit von Restriktionsendonucleasen (die Duplex-DNA an spezifischen Nucleotidsequenzen spalten) und der Entwicklung der molekularen Klonierung (die eine Genamplifikation jedes identifizierbaren DNA-Segments ermöglicht) – den Weg zur Sequenzierung von DNA ebneten. Dies ist zum einen eine Methode der chemischen Spaltung, das Maxam-Gilbert-Verfahren [A.M. Maxam u. W. Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977) 560-564; Methods Enzymol. 65 (1980) 499-560] und zum zweiten die Methode des Kettenabbruchs (Didesoxymethode, Sanger-Sequenzierung) mit Hilfe von Didesoxyribonucleotidtriphosphatasen [F. Sanger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977) 5.463-5.467].

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