Pyruvat-Carboxylase (EC 6.4.1.1), eine Biotin abhängige Ligase tierischer und pflanzlicher Herkunft, die die Addition von CO₂ an Pyruvat katalysiert:

Pyruvat + CO₂ + ATP + H₂O

Oxalacetat + ADP + P_i.

Das Enzym ist Mn²⁺-abhängig und in Abwesenheit seines positiven allosterischen Effektors Acetyl-CoA praktisch inaktiv. Diese Reaktion stellt eine wichtige frühe Stufe der Gluconeogenese dar und ist ein Beispiel für eine CO₂-Fixierung im tierischen Organismus. Zur Art der Bindung des Coenzyms Biotin und zum Mechanismus der CO₂-Übertragung Biotinenzyme. Die aktive Form der P. ist ein Tetramer [M_r 600 kDa (Hefe), 650 kDa (Hühnerleber) bzw. 520 kDa (Schweineleber)], das mit den korrespondierenden Dimeren und Monomeren im Gleichgewicht steht. Die Dimere und Monomere (M_r 130 kDa, 3 Ketten, M_r je 47kDa) sind ebenfalls enzymatisch aktiv. Die Vogelleber-P. ist ein kälteempfindliches Enzym, das bei 0 °C reversibel in sein inaktives Monomer (M_r 160 kDa) zerfällt. Wie alle Biotinenzyme wird P. durch Avidin inaktiviert, da Biotin als Avidin-(Biotin)₄-Komplex gebunden wird.

Die ebenfalls Biotin-abhängige Acetyl-Coenzym-A-Carboxylase und die P. sollen sich aufgrund struktureller Ähnlichkeiten aus einem gemeinsamen Vorläuferenzym entwickelt haben.