Tetrahydrofolsäure, FH₄, Folat-H₄, Coenzym F, 5,6,7,8-Tetrahydropteroylglutaminsäure, bindet, aktiviert und überträgt aktive Einkohlenstoff-Einheiten mit Ausnahme von Kohlendioxid (F bedeutet Formylierung). Mr 445,4Da, bei chemischer Präparation aus Essigsäure Mr 565,4Da (mit 2 CH₃-COOH), λ_max 298nm in 0,01M Phosphatlösung, pH 7,0, ε ¥ 28.000. T. wird in festem Zustand langsam an der Luft oxidiert und muss deshalb im Vakuum oder in inerter Atmosphäre aufbewahrt werden. In Lösung wird T. schnell zur Dihydrofolsäure, (FH₂, Folat-H₂, 7,8-Dihydropteroylglutaminsäure) oxidiert. FH₂ entsteht außerdem als Nebenprodukt der enzymatischen Bildung von Thymidylsäure an der Thymidylat-Synthase (Pyrimidinbiosynthese). FH₄/FH₂ bilden ein Redoxsystem von E₀' = -0,19V. Die Stabilität von T. wird stark vom Puffer beeinflusst, sie ist bei pH 7,4 am größten. Stabilisierend auf Lösungen von T. wirken Ascorbinsäure (34 mM) und – weniger ausgeprägt – Mercaptoethanol (10 mM). Die Zersetzung von T. oder ihre metabolische Umwandlung zu Dihydrofolsäure lässt sich spektrophotometrisch durch die Verlagerung des Absorptionsmaximums von 298nm zu 282nm verfolgen.

T. wird aus Folsäure durch enzymatische Reduktion gebildet. Die aktive Gruppierung der T. ist die Ethylendiamingruppierung.

Tetrahydrofolsäurekonjugate enthalten drei bzw. sieben Glutaminsäuren: Tri- bzw. Heptaglutamate. Sie spielen z.B. eine Rolle bei der Methioninsynthese in einigen Mikroorganismen.