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Kompaktlexikon der Biologie: Nucleinsäurehybridisierung

Nucleinsäurehybridisierung, der Nachweis von auf einer Nylonmembran oder einem Nitrocellulosefilter immobilisierter DNA oder RNA mit Hilfe von radioaktiv markierten oder neuerdings auch chemisch modifizierten Gensonden. Aufgrund der komplementären Basenpaarung können diese einzelsträngigen kurzen DNA- oder RNA-Fragmente spezifisch an diejenigen Bereiche binden, mit deren Sequenz sie übereinstimmen. Durch Wahl der Hybridisierungsbedingungen wie z.B. Hybridisierungstemperatur oder Salzkonzentration der Pufferlösung sowie anschließende Waschschritte bei z.T. unterschiedlichen Temperaturen und Pufferkonzentrationen wird erreicht, dass weitestgehend spezifische Bindungen und möglichst keine unspezifischen Bindungen zwischen Sonde und DNA bzw. RNA zustande kommen. Sie können durch Autoradiographie nachgewiesen werden.

Die aus Probenmaterial isolierten Nucleinsäuren werden zunächst durch eine Gelelektrophorese getrennt und anschließend in einem ursprünglich von E. Southern erdachten Transfersystem für DNA aus dem üblicherweise verwendeten Agarosegel auf die Membran übertragen. Das Gel wird hierzu auf ein angefeuchtetes Filterpapier aufgetragen, dessen Enden in eine Wanne mit Transferpuffer ragen. Unmittelbar darüber wird die Membran blasenfrei gelegt und mehrere Lagen saugfähiges Filterpapier, das zusätzlich mit einem Gewicht beschwert wird ( vgl. Abb. ). Die Pufferlösung wird vom trockenen Filterpapier aufgesaugt, wobei die DNA-Fragmente mittels Kapillarkräften aus dem Gel an die Unterseite der Membran wandern, wo sie aufgehalten werden. Im Anschluss an den Transfer, der nach mehreren Stunden abgeschlossen ist, wird die DNA durch Hitze- oder UV-Behandlung kovalent an der Membran fixiert. Während mit dem Ergebnis des Southern Blotting, dem Southern Blot der Nachweis von DNA-Fragmenten z.B. für den genetischen Fingerabdruck oder die RFLP-Analyse möglich ist, wird im Laborjargon der analoge Nachweis von mRNAs als Northern Blot bezeichnet ( vgl. Abb. ). Werden Nucleinsäuren vor der Hybridisierung nicht ihrer Größe nach aufgetrennt, sondern die isolierten DNA- oder RNA-Lösungen als Punkte oder schlitzförmige Flecken auf die Membran aufgetragen, spricht man von einem so genannten Dot Blot oder Slot Blot. Auf diese Weise können wie auf einer Mikrotiterplatte viele Proben gleichzeitig analysiert werden. Die N. gestattet es, i.d.R. nur ein Gen pro N. zu untersuchen. Die Effizienz der N. wird bei DNA-Chips (Biochips, Microarray) wesentlich gesteigert.

Eine nach demselben Prinzip ablaufende Nachweismethode von Nucleinsäuren, die nicht auf Membranen immobilisiert, sondern in Gewebeschnitten vorkommen, ist die In-situ-Hybridisierung.



Nucleinsäurehybridisierung: Typischer Aufbau eines Southern- oder Northern Blots. Der „Dichtungsring“ wird häufig eng um das Gel gelegt, damit das Filterpapier nicht außerhalb des Gels saugen kann, der Blot dadurch „kurzgeschlossen“ wird und der erwünschte Transfer ausbleibt. NC-Filter = Nitrocellulosefilter, 3MM-Papier = Lagen mit besonders saugfähigem, festen Filterpapier



Nucleinsäurehybridisierung: Typischer Ablauf eines Experimentes zum Nachweis von bestimmten DNA- oder mRNA-Molekülen mittels Southern bzw. Northern Blot

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Professor Dr. Wilfried Wichard, Institut für Biologie und ihre Didaktik, Universität zu Köln

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Thomas Birus, Kulmbach (Der globale Mensch und seine Ernährung)
Dr. Daniel Dreesmann, Köln (Grün ist die Hoffnung - durch oder für Gentechpflanzen?)
Inke Drossé, Neubiberg (Tierquälerei in der Landwirtschaft)
Professor Manfred Dzieyk, Karlsruhe (Reproduktionsmedizin - Glück bringende Fortschritte oder unzulässige Eingriffe?)
Professor Dr. Gerhard Eisenbeis, Mainz (Lichtverschmutzung und ihre fatalen Folgen für Tiere)
Dr. Oliver Larbolette, Freiburg (Allergien auf dem Vormarsch)
Dr. Theres Lüthi, Zürich (Die Forschung an embryonalen Stammzellen)
Professor Dr. Wilfried Wichard, Köln (Bernsteinforschung)

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