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Lexikon der Biologie: binding site selection assay

binding site selection assay, Abk. BSSA, Methode zur Ermittlung der bevorzugten Bindestellen von DNA-bindenden Proteinen (DNA-Protein-Interaktion). Für den binding site selection assay wird eine Kombination des electrophoretic mobility shift assay (EMSA; band shift assay; band shift) und der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) verwendet ( vgl. Abb. ). Eine saubere Präparation des zu untersuchenden Proteins wird mit einer Vielzahl von markierten doppelsträngigen, synthetisch hergestellten Oligonucleotiden definierter Länge und statistischer Basenzusammensetzung zur Reaktion gebracht. Diese "random oligos" (in diesem Fall doppelsträngig) setzen sich oft wie folgt zusammen: eine zentrale Region von z. B. 17 Basenpaaren (die Größe dieser Region richtet sich nach der erwarteten oder ermittelten minimalen Größe der Bindestelle des betreffenden Proteins) enthält statistisch zusammengesetzte Basenabfolgen in einer Weise, daß jede der möglichen Basensequenzen (hier: 417 Kombinationsmöglichkeiten) in dem Gemisch enthalten ist. Flankierend hierzu befinden sich Bereiche mit definierten Basenabfolgen (meist ca. 20 Basenpaare lang), die als Bindungsstellen für die in der PCR einzusetzenden definierten PCR-primer (meist ebenfalls 20 Nucleotide lang) dienen. Nach Beendigung der Bindungsreaktion der Proteine werden gebildete Protein/Oligonucleotid-Komplexe durch EMSA-Gelelektrophorese von den nicht gebundenen random oligos getrennt und die spezifisch gebundenen DNAs nach Lokalisation (aufgrund der Markierung möglich) aus den Protein/DNA-Komplexen herausgelöst. Unter Einsatz der an die definierten Enden der random oligos bindenden PCR-primer werden nun die wenigen, jedoch spezifisch von den Proteinen gebundenen und aus der Gesamtheit aller angebotenen random oligos selektierten oligo-DNAs amplifiziert. Die amplifizierten Oligonucleotide können nun in einer erneuten Bindungsreaktion zusammen mit Protein eingesetzt werden. Diese Abfolge von Bindung/EMSA/PCR wird zur weiteren Selektion und Absonderung weniger spezifisch gebundener oligo-DNAs meist noch mehrmals (insgesamt 3–5mal) durchgeführt. Die schließlich erhaltenen, amplifizierten DNAs repräsentieren je nach Bindungsspezifität oder -präferenz der untersuchten Proteine immer noch eine Mehrzahl von individuellen Sequenzabfolgen. Diese werden daher zunächst in ihrer Gesamtheit in geeignete Vektoren kloniert. Anschließend wird eine für statistische Analysen angemessene Anzahl von Einzelklonen (meist 30–50) einer Sequenzanalyse (Sequenzierung) unterzogen. Durch Vergleich der erhaltenen Sequenzen der unterschiedlichen oligo-DNAs kann eine Consensus-Sequenz für bevorzugte Bindestellen des untersuchten Proteins erstellt werden.

E.G.




binding site selection assay

Schema zum Ablauf eines binding site selection assay

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