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Lexikon der Biologie: Gasphasen-Sequenator

Gasphasen-Sequenator m, Gerät, das nach dem Prinzip des Edmanschen Abbaues die Ermittlung der Aminosäuresequenz von Proteinen und Peptiden erlaubt ( vgl. Abb. ). Nach jedem Zyklus des schrittweisen Abbaues kann eine Aminosäure als stabiles Phenylthiohydantoin-Derivat mit Hilfe von HPLC durch Vergleich mit der Retentionszeit von Standards identifiziert werden. Der Flüssigphasen-Sequenator erfordert 5–10 nmol Protein für die Sequenzermittlung, der Gasphasen-Sequenator hingegen kommt mit 20–100 pmol aus („Mikrosequenzierung“), was es häufig auch ermöglicht, die Aminosäuresequenz von relativ schwach exprimierten Proteinen zu ermitteln. Beim Gasphasen-Sequenator wird das gereinigte Protein an ein Glasfaserfilter gekoppelt, auf dem dann die Reaktionen des Edman-Abbaues durchgeführt werden. Die Reagenzien werden von der Gasphase (Argon) getragen, was durch Reduktion der Lösungsmittel-, Reagenzien- und Nebenproduktmenge die beobachtete höhere Sensitivität bringt. Bei den genannten Picomol-Mengen an Protein lassen sich bis ca. 50 Aminosäuren vom Aminoterminus bestimmen. Wenn man mehr Sequenzinformation erhalten möchte, müssen vorher chemische oder enzymatische Fragmentierungen der Proteine vorgenommen werden, um anschließend die Aminosäuresequenzen der erhaltenen Peptide zu analysieren. Da die Peptid-Sequenzierung trotz aller Fortschritte ein relativ schwieriges Verfahren ist, begnügt man sich häufig mit der Ermittlung von Teilsequenzen und nutzt diese, um anhand des genetischen Codes die den Peptiden entsprechende DNA-Sequenz abzuleiten. Die korrespondierenden Oligonucleotide lassen sich mit Hilfe eines DNA-Synthesizers synthetisieren (Oligonucleotidsynthese) und als Hybridisierungssonde (Hybridisierung) zur Identifizierung der entsprechenden cDNA-Klone (cDNA) in einer cDNA-Bibliothek (Expressionsbibliothek, Genbibliothek) einsetzen. Aus diesen kann durch Sequenzierung (DNA-Sequenzer) relativ einfach die DNA-Sequenz, die für das betreffende Protein codiert, ermittelt werden. Aus dieser läßt sich wiederum anhand des genetischen Codes die totale Aminosäuresequenz des Proteins ableiten.



Gasphasen-Sequenator

Prinzip des Edmanschen Abbaus, wie er auch im Gasphasen-Sequenator bei der Peptidsequenzierung abläuft (TFA = Trifluoressigsäure).

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