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Lexikon der Biologie: Gelelektrophorese

Gelelektrophorese w, wichtige Methode zur Auftrennung von Gemischen elektrisch geladener hochmolekularer Stoffe, besonders von Nucleinsäuren und Proteinen sowie deren Fragmenten ( vgl. Abb. ). Diese wandern dabei innerhalb eines Gels (Gele) unter der Wirkung eines elektrischen Feldes in Abhängigkeit von Ladungsanzahl und Molekülmasse unterschiedlich schnell zu den jeweiligen Polen. Die aufzutrennenden Makromoleküle werden dabei entweder in nativer Form erhalten (native Gelelektrophorese) oder, um die auf Sekundär-, Tertiär- und Quartärstrukturen basierenden Effekte auszuschalten, durch entsprechende Agenzien denaturiert (denaturierende Gelelektrophorese). Besondere Bedeutung hat die Gelelektrophorese in Agarosegelen (Agar) und in Polyacrylamidgelen erlangt, da die Porengrößen dieser Gele mit Hilfe der Konzentration bzw. des Vernetzungsgrades der Gelbildner genau eingestellt und damit dem jeweiligen Trennproblem angepaßt werden können. Um die Auflösung bei der Trennung zu verbessern, können die Monomerkonzentration und der Vernetzungsgrad kontinuierlich verändert werden (Gradientengele). Zur Gelelektrophorese von Proteinen, die auch zur Bestimmung von deren relativer Molekülmasse herangezogen werden kann, werden diese häufig mit Natrium-Dodecylsulfat (SDS) denaturiert und gleichzeitig durch hydrophobe Bindung mit demselben Agens in eine anionische Form überführt (SDS-Gelelektrophorese; SDS-PAGE = SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese). Die heute gebräuchlichste Form der Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) ist die hochauflösende Disk-Elektrophorese, bei der das Gel eine Zweiteilung in Sammelgel und Trenngel aufweist. Weitere gebräuchliche Methoden sind u.a. die isoelektrische Fokussierung, die zweidimensionale Gelelektrophorese, die Immunelektrophorese und die Blaue Nativ-Polyacrylamid-Gelelektrophorese von Proteinen. Nucleinsäuren und Polynucleotide sind im Gegensatz zu Proteinen Polyanionen mit gleichmäßiger Ladungsdichte; ihre Wanderung im elektrischen Feld ist daher relativ pH-unabhängig (pH-Wert), und sie müssen nicht mittels SDS erst in anionische Form überführt werden. Ihre Auftrennung kann je nach Fragestellung in Agarose- oder Polyacrylamidgelen erfolgen. Ist eine Denaturierung etwa zur Vermeidung von Sekundärstruktureffekten nötig, wird u.a. Harnstoff (Harnstoff-Gelelektrophorese), bei Auftrennung von RNA vor allem Formaldehyd und Glyoxal eingesetzt. Nach der Gelelektrophorese können die aufgetrennten Makromoleküle oder deren Fragmente durch besondere Färbetechniken (Färbemethoden) im Gel lokalisiert werden. Für Nucleinsäuren werden in der Regel Ethidiumbromid (Ethidiumion), für Proteine hingegen Coomassie-Brillantblau oder Silberionen (Silberfärbung) verwendet. Im Anschluß an eine Auftrennung unter nativen Bedingungen können auch spezifische Eigenschaften von Proteinen zum direkten Nachweis im Gel genutzt werden; z.B. ist der Nachweis von Enzymen mittels eines spezifischen Substrats und eines daran gekoppelten Farbstoffs möglich. Die bei weitem empfindlichste Detektion gelingt bei radioaktiv markierten Proteinen mittels Autoradiographie und Fluorographie. Nucleinsäuren und Proteine können außerdem nach Auftrennung im präparativen Maßstab aus dem Gel eluiert (eluieren) oder nach analytischer Gelelektrophorese auf Membranen transferiert und anschließend identifiziert und/oder quantifiziert werden (blotting-Techniken). Durch Vergleich mit geeigneten Marker-Molekülen (Marker) läßt sich eine Größenabschätzung der aufgetrennten Moleküle durchführen. Direkt-blotting-Elektrophorese, Elektrophorese (Abb.), Gegenstromelektrophorese, Kapillarelektrophorese, Puls-Feld-Gelelektrophorese, Serumproteine, Sequenzierung.

H.K./K.G./M.B.



Gelelektrophorese

Analyse der Reinigung von RNA-Polymerase mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese. Die nach den einzelnen Reinigungsschritten noch vorhandenen Proteine wurden durch Färbung mit Coomassie-Brillantblau sichtbar gemacht. Links Zellextrakt, gefolgt von verschiedenen Reinigungsschritten, rechts die 4 Untereinheiten des gereinigten Enzyms.

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