Lexikon der Biologie: in-situ-Hybridisierung
in-situ-Hybridisierung w, eine besondere Anwendung der molekularen Hybridisierung, bei der die Zusammenlagerung von komplementären Nucleinsäuresträngen in geeignet fixierten Schnitten von Geweben oder Zellen durchgeführt wird. Diese Technik wird vor allem für 2 Anwendungen eingesetzt: 1) Durch Nachweis der mRNA des untersuchten Gens in Gewebeschnitten läßt sich feststellen, in welchen Zellen des Gewebes das jeweilige Gen angeschaltet ist. 2) Durch Hybridisierung an Chromosomen, also an die DNA, läßt sich ein bestimmtes Gen in den Chromosomen lokalisieren. Es lassen sich so aber auch Chromosomenanomalien sichtbar machen, also ein Karyotypogramm (Karyogramm) erstellen – wichtig für die Diagnose von Erbkrankheiten. Die in-situ-Hybridisierung ist also eine wichtige Ergänzung für Northern- und Southern-Studien (blotting-Techniken), bei denen nur die Gesamtmenge einer bestimmten mRNA oder einer bestimmten DNA festgestellt werden kann, nicht aber deren räumliche Verteilung. Da die Hybridisierungsreaktionen in einer festen Matrix (z.B. in Gewebeschnitten) erfolgen, müssen im Vergleich zur normalen Vorgehensweise besondere Maßnahmen durchgeführt werden. Die zu verwendenden Gewebeschnitte müssen sehr dünn sein, was in der Regel die Hilfe eines Ultramikrotoms erforderlich macht. Die Dünnschnitte werden auf Objektträger überführt und mit Glutardialdehyd fixiert und entwässert. In den Zellen enthaltene DNA kann durch eine Behandlung der Schnitte mit Alkali-Lösungen denaturiert und so für die Hybridisierungsproben besser zugänglich gemacht werden. Die Hybridisierung selbst erfolgt meist durch Zugabe einer markierten DNA- oder RNA-Sonde direkt auf die Oberfläche des Dünnschnitts (Gensonde). Um jeweils geeignete Hybridisierungsbedingungen und den erforderlichen Grad der Spezifität der Sonde einzustellen, andererseits jedoch die grundlegenden Strukturen der Zellen in den Schnitten nicht durch hohe Temperaturen zu zerstören, werden denaturierende und somit die Hybridisierungs-Temperatur herabsetzende Reagenzien (z.B. Formamid) dem Ansatz in geeigneter Menge zugesetzt, so daß Temperaturen bis zu maximal 40 °C für die Durchführung der in-situ-Hybridisierung ausreichend sind. Der gesamte Ansatz wird schließlich durch ein Deckglas versiegelt und rundherum abgedichtet. Nach Abschluß der Hybridisierungsreaktion wird das Deckglas entfernt und der Schnitt gewaschen. Die eingesetzte Sonde muß nun sichtbar gemacht werden. Klassischerweise werden dazu bei der Synthese der Gensonde radioaktiv markierte Nucleotide verwendet (hierbei wird meist Tritium [3H] als radioaktives Isotop eingesetzt). Nach dem Waschen kann der Schnitt mit einer Röntgenfilmemulsion überzogen werden, und an den Orten, an denen Hybridisierungen stattgefunden haben, lassen sich nach einer gewissen Expositionszeit mikroskopisch Silberkörner in der über den Zellschnitten liegenden Filmschicht nachweisen (Mikro-Autoradiographie). In den letzten Jahren wird die radioaktive „Färbung“ zunehmend durch nichtradioaktive Methoden ersetzt ( vgl. Infobox ). – Ein zentrales Problem der in-situ-Hybridisierung ist die Spezifität des Signals. Vor allem in Gewebeschnitten können auch unspezifische Bindungen, z.B. an Lectine oder Glykoproteine, auftreten und ein Signal vortäuschen. Daher werden als Negativkontrollen sog. sense-Sonden eingesetzt; es wird also nicht der komplementäre Strang als Sonde eingesetzt, sondern ein Stück der mRNA selbst. Damit lassen sich dann unspezifische Bindungen erkennen und von echten Signalen trennen. – Die in-situ Hybridisierung kann mit anderen cytologischen Untersuchungs- und Färbemethoden bei Einsatz eines Präparats kombiniert werden; z.B. können die Zellen und Chromosomen mit Zellfarbstoffen, wie z.B. Propidiumiodid und 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI), gegengefärbt werden. chromosomale in-situ-Suppressionshybridisierung, Chromosomenkarte ( Chromosomenkarte I
Chromosomenkarte II
Chromosomenkarte III
Chromosomenkarte IV
), in-situ-PCR, Markierung.
E.G./B.G./P.N.
Schreiben Sie uns!