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Lexikon der Biologie: in-vitro-Mutagenese

in-vitro-Mutagenese w, Veränderung der DNA-Sequenz eines klonierten Gens in vitro. Ziel ist meist die Struktur- und Funktionsanalyse eines Proteins, das von dem mutagenisierten Gen codiert wird oder, bei Mutagenese des 5'-untranslatierten Sequenzbereichs, die Untersuchung von Promotor-Elementen, welche die Expression des Gens regulieren (Genregulation). Die lange Zeit übliche Zufallsmutagenese durch mutagene Agenzien wie Ethylmethansulfonat (EMS) oder Diethylsulfat wurde durch moderne Methoden ersetzt, die eine zielgerichtete bzw. ortsspezifische Mutagenese (site-directed mutagenesis) der DNA erlauben. Bei dem klassischen zielgerichteten Verfahren, der Hybrid- oder Kunkel-Methode, werden einzelsträngige Phagen-DNA (einzelsträngige DNA-Phagen) und thermolabile DNA-Polymerasen eingesetzt, um gezielt Mutationen zu generieren. Moderne Methoden basieren meist auf Varianten der Polymerase-Kettenreaktion (PCR), z.B. Overlap-extension-PCR, Megaprimer-PCR oder inverse PCR, die mit klassischen Klonierungstechniken (Restriktionsenzyme, Ligation) kombiniert werden. Die Änderung der genetischen Information wird durch maßgeschneiderte, synthetische PCR-primer (Oligonucleotide; Oligonucleotid-gerichtete Mutagenese, Oligonucleotid-Mutagenese) erreicht. Mit diesen Verfahren können sowohl Punktmutationen (Basenaustauschmutationen) und daraus folgend Codonwechsel, Deletionen und verschachtelte (nested) Deletionen, Insertionen oder multiple Mutationen in beliebigen Positionen eingeführt werden. Die biologische Aktivität der mutierten Nucleinsäuren läßt sich sowohl mit in-vitro- als auch in-vivo-Methoden testen (reverse Genetik). Mutagenese.

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