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Lexikon der Biologie: mikroskopische Präparationstechniken

mikroskopische Präparationstechniken, Vorbereitung vornehmlich kleiner Objekte zur Betrachtung im Lichtmikroskop (Mikroskop) oder Elektronenmikroskop. Lichtmikroskopische Objekte werden in der Regel auf einen gläsernen Objektträger aufgebracht, zur Verminderung der Licht-Brechung und -Streuung an den unebenen Objektoberflächen in ein homogenes und durchsichtiges Medium (z.B. Wasser) eingeschlossen und zur Schaffung einer ebenen Oberfläche mit einem 0,17 mm dicken Glasplättchen (Deckglas) abgedeckt, während elektronenmikroskopische Objekte auf einem mit einer monomolekularen Kunststoffhaut überzogenen Kupfersiebchen als Objektträger in den Elektronenstrahl eingeführt werden.
Lichtmikroskopie: Einzelzellen oder kleinere Organismen können, in Wasser eingeschlossen, lebend untersucht werden (Frischpräparat, Nativpräparat). Will man solche Lebendpräparate – etwa Zell- oder Einzeller-Kulturen – längere Zeit beobachten, ohne daß sie eintrocknen, so müssen diese in (unter Umständen temperaturkonstante) Mikrobeobachtungskammern eingeschlossen werden, die eine Zufuhr von Sauerstoff und eventuell Nährstoffen ermöglichen. Zur Erhöhung des Kontrastes kann man lebende, meist kontrastlose Objekte mit nicht toxischen Vitalfarbstoffen (Nilblausulfat, Neutralrot) anfärben, die sich in manchen Fällen in bestimmten Zell-Organellen (Zellkern, Lysosomen) oder bei mehrzelligen Organismen in einzelnen Geweben anreichern. Zur Darstellung besonders kleiner Zellen, Cilien, Geißeln usw. eignet sich auch eine Negativkontrastierung, bei der die betreffenden Objekte in eine dünne Tuschelösung eingebracht werden, in der sie sich bei entsprechend dünner Schicht als durchsichtige Strukturen vor dunklem Hintergrund abheben. Heute werden statt dessen in aufwendiger ausgestatteten Mikroskopen spezielle optische Kontrastierungsverfahren (Phasenkontrastmikroskopie, Interferenzmikroskopie) mit besserem Erfolg angewandt. Von unbelebten oder abgetöteten Objekten können praktisch unbegrenzt haltbare Dauerpräparate angefertigt werden, indem man die betreffenden Objekte – unter Umständen nach vorhergehender Konservierung (Fixierung) – mit einem glasklar durchsichtigen und erhärtenden Einschlußmedium durchtränkt und sie unter einem Deckglas darin einbettet (Einschlußpräparat), entweder in wasserlösliche Einbettungsmittel wie Gelatine, Glyceringelatine und hydrophile Kunstharze wie Gelatinol® oder Lactophenol (ein Phenol-Milchsäure-Glycerin-Gemizuh), auch in alkohollösliche Einbettlacke wie Gelatinol® und Euparal®, oder in benzol- oder xylollösliche Naturharze wie Kanadabalsam oder Kunstharzlacke wie Caedax® und Eukitt®. Zur besseren Darstellung von Zellen, Zellkernen oder unterschiedlichen Gewebetypen können solche Präparate insgesamt mit verschiedenen Farbstoffen angefärbt werden (Färbemethoden) oder, falls sie undurchsichtig sind (z.B. bei Chitinstrukturen [Chitin] von Insektenpanzern) mit Bleichmitteln aufgehellt (aufhellen; Diaphanol = Chlordioxid-Essigsäure; Kaliumhypochlorit-Lösung, H2O2) bzw. durch Durchtränken mit Flüssigkeiten von hohem Brechungsindex (Methylbenzoat) durchsichtig gemacht werden. Von größeren, besonders pflanzlichen Objekten lassen sich zur Darstellung von Zellen und Gewebestrukturen durch Zerzupfen mit 2 Nadeln Zupfpräparate gewinnen, während sich bei tierischen Geweben (z.B. Nervenzelldarstellung [Nervenzelle] aus Nervengeweben, Chromosomendarstellung [Chromosomen] in Mitosepräparaten) eher die Anfertigung von Quetschpräparaten durch Zerquetschen des Gewebes zwischen Deckglas und Objektträger nach vorheriger Mazeration empfiehlt. Zur Untersuchung kompakter Gewebe oder Organe bzw. ganzer Organismenquerschnitte (Histologie) muß man die Objekte in je nach darzustellender Struktur 2–20 μm dicke Scheiben zerschneiden (histologische Schnittpräparate). Dies erfordert eine vorherige Härtung der fixierten Objekte durch Einfrieren (Gefrierschnitte) oder Einbettung des histologischen Materials in alkohollösliche Dinitrocellulose (Celloidin), xylol- und benzollösliches Paraffin oder dioxanlösliche Kunstharze. All diese Einbettungen verlangen zur vollkommenen Durchtränkung des zu schneidenden Materials eine vorherige schonende Entwässerung in Wasser-Alkohol-Stufen steigender Konzentration (Alkoholreihe) und, gegebenenfalls daran anschließend, Alkohol-Xylol-(Benzol, Dioxan)-Stufen. Von den so erhaltenen erhärteten Gewebeblöckchen können an einem Mikrotom Schnitte gewünschter Dicke abgehobelt werden, die man dann auf Wasser aufschwimmen läßt und unter leichter Erwärmung streckt, auf einem Objektträger auffängt, durch Erwärmen festklebt und dann nach Herauslösen des Paraffins und Wiedereinbringen in Wasser mit verschiedensten Farbstoffen anfärben kann. Dabei lassen sich durch die Wahl des Farbstoffs ganz gerichtet bestimmte Zellorganelle oder Gewebestrukturen je nach deren chemischen oder physikalischen Eigenschaften hervorheben (z.B. Azanfärbung, Hämatoxylin-Eosin-Färbung; Histochemie). So werden basische Farbstoffe (z.B. Hämatoxylin) begierig von sauren Zellstrukturen (DNA im Kern, RNA in ribosomenreichen Plasmaarealen wie Ergastoplasma) gebunden (Basophilie; basiphil), während die in der Mehrzahl basischen Plasmaproteine (Serumproteine) bevorzugt saure Farbstoffe (Säurefarbstoffe) wie Eosin binden (Hämatoxylin-Eosin-Färbung). Reduzierend wirkende Membranoberflächen (Membran) lassen sich durch Versilberung (Versilberungsfärbung) oder Vergoldung, d.h. durch Ausfällung reduzierter Metallgranula, vergröbern und so lichtmikroskopisch sichtbar machen. Die so gefärbten Präparate werden nach erneuter Überführung in ein organisches Lösungsmittel (Alkohol, Benzol, Xylol) mit einem der obengenannten Einbettlacke überzogen und mit einem Deckglas abgedeckt. Solche Präparate sind unbegrenzt haltbar, wenn die verwendeten Farbstoffe resistent sind gegen allmähliche Photooxidation oder pH-Wechsel innerhalb des Präparats. Auch von Hartstrukturen wie Knochen lassen sich nach deren vorheriger Entkalkung auf elektrophoretischem Wege (Elektrophorese) oder durch Einlegen in verdünnte Säuren Dünnschnitte anfertigen, oder es müssen statt der Schnitte Dünnschliffe hergestellt werden. Von pflanzlichem Material gelingt es auch, brauchbare Schnitte durch Einklemmen des Gewebes in Holundermark und Überschneiden mit einer Rasierklinge zu gewinnen. Falls an Dauerpräparaten polarisationsoptische (Polarisation) oder fluoreszenzmikroskopische (Fluoreszenzmikroskopie) Untersuchungen durchgeführt werden sollen, muß man bei der Wahl des Einschlußmittels darauf achten, daß dieses nicht selbst optisch aktiv ist oder eine Eigen-Fluoreszenz besitzt. – Von Zellsuspensionen, z.B. Blutzellen, lassen sich durch Ausstreichen eines Suspensionsfilms auf einem Objektträger und anschließende rasche Wärmefixierung Ausstrichpräparate (Ausstrich) herstellen, die nach ihrer Färbung uneingedeckt als Trockenpräparate aufbewahrt werden können, dann bei der mikroskopischen Beobachtung aber unbedingt in Öl-Immersion (Mikroskop) betrachtet werden müssen.
Elektronenmikroskopie: Entsprechende Verfahren wie in der Lichtmikroskopie werden auch in der elektronenmikroskopischen Präparationstechnik angewandt, wobei wegen der notwendigerweise geringeren Schnittdicken von etwa 10–80 nm die Objekte in Kunstharze (Epoxidharze wie Araldit®, Maraglas® und Epon oder Methacrylat®) eingebettet werden müssen. Die notwendigen Ultradünnschnitte werden an einem Ultramikrotom mit Hilfe von Glas- oder Diamantmessern geschnitten. An die Stelle der Färbung in der Lichtmikroskopie tritt die Kontrastierung mit elektronendichten Schwermetallsalzen (Elektronenmikroskop). Neuentwickelte hydrophile Kunstharze, in denen Zellen ohne vorausgehende Entwässerung eingebettet werden können, ermöglichen heute nach schonender Fixierung der Zellen in Formaldehyd auch noch enzymhistochemische Untersuchungen an fertigen Ultradünnschnitten. Gefrierätztechnik, Kryofixierung, Metallbeschattung, Platinbedampfung.

P.E.

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