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Lexikon der Biologie: Oligonucleotid-Mutagenese

Oligonucleotid-Mutagenese w, oligonucleotide mediated mutagenesis, eine Methode zum punktgenauen und zielgerichteten Einführen von ein- oder mehrfachen Punktmutationen, Deletionen oder Insertionen in klonierte Gene oder andere klonierte DNA-Abschnitte. Die Auswirkungen dieser Veränderungen, z.B. auf die Funktion der von den mutierten Sequenzen exprimierten Proteine, kann in Folgeuntersuchungen analysiert werden. Für die Oligonucleotid-Mutagenese synthetisiert man Oligonucleotide von 15 bis 20 Basenpaaren Länge, die zu der zu mutagenisierenden DNA-Zielsequenz fast genau basenkomplementär (Basenkomplementarität) sind. Nur die Position(en), die verändert werden soll, weicht von der ursprünglichen Basensequenz ab. Das synthetische Oligonucleotid kann nun an die zuvor durch Denaturierung einzelsträngig gemachte Zielsequenz hybridisiert (Hybridisierung) werden, wobei die eine oder die wenigen Positionen, die verändert werden sollen, ungepaart bleiben ( vgl. Abb. ). Ausgehend von dem auch als primer fungierenden Oligo kann danach mit einer DNA-Polymerase und einem Gemisch der 4 dNTPs (2'-Desoxyribonucleosid-5'-triphosphate) und anschließender Ligation wieder ein DNA-Doppelstrang hergestellt werden, der im Bereich des Oligonucleotids einige Fehlpaarungen aufweist. Mit diesen Molekülen können Bakterien transformiert (Transformation) werden. Nach der ersten Replikationsrunde (Replikation) erhält man dann Nachkommenmoleküle, von denen die Hälfte von dem ursprünglichen Strang resultiert und daher keine Veränderungen aufweist. Die andere Hälfte resultiert von dem das Oligonucleotid mit der veränderten Sequenz tragenden Strang. Diese mutanten Moleküle können für anschließende Untersuchungen gewonnen werden. Für die Anwendung der Oligonucleotid-Mutagenese werden die zu bearbeitenden Sequenzen (Sequenzierung) oft in Vektoren einkloniert, die sich von einzelsträngigen DNA-Phagen, wie z.B. M13, ableiten, da diese während ihres Lebenszyklus eine einzelsträngige Phase durchlaufen. Die einzelsträngige DNA, in der auch die einklonierte, zu mutagenisierende Zielsequenz einzelsträngig vorliegt, kann isoliert und so direkt für die Hybridisierung mit den Oligonucleotiden eingesetzt werden.



Oligonucleotid-Mutagenese

Grundprinzip der Oligonucleotid-Mutagenese.
Statt nur eine Fehlpaarung können die synthetisierten Oligonucleotide auch mehrere Fehlpaarungen oder auch kleine Insertionen oder Deletionen tragen.

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