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Lexikon der Biologie: Oligonucleotidsynthese

Oligonucleotidsynthese w, die organisch-chemische Synthese von Oligonucleotiden durch Knüpfung einer Phosphodiesterbindung zwischen der 5´-Hydroxylgruppe des einen Nucleotids und der 3´-Phosphatgruppe des anderen Nucleotids oder umgekehrt zwischen einer 3´-Hydroxylgruppe und einem 5´-Phosphat zweier Nucleotide. Für präparative Oligonucleotidsynthesen wird wegen der höheren chemischen Reaktivität der primären 5´-Hydroxylgruppe fast ausschließlich die zuerst genannte Reaktion verwendet. Die funktionellen Gruppen der Mononucleotide werden durch selektiv abspaltbare Schutzgruppen reversibel blockiert, um unerwünschte Nebenreaktionen während der Knüpfung der Internucleotidbindung weitgehend zu vermeiden und die Synthese in die gewünschte Richtung zu drängen. Als Schutzgruppe für die primäre 5´-Hydroxylfunktion fungiert die mit aromatischen Sulfonsäuren, Trifluoressigsäure oder ZnBr2 abspaltbare Dimethoxytritylgruppe (DMTr), während für die sekundäre 3´-Hydroxylfunktion vorrangig basenlabile Acetyl- bzw. Benzoylreste eingesetzt werden. Bei der Synthese von Oligoribonucleotiden muß außerdem deren zusätzliche 2´-Hydroxylgruppe geschützt werden. Als N-Schutzgruppen der Nucleinsäurebasen werden der Anisoylrest für Cytosin, der Benzoylrest für Adenosin und der Isobutyrylrest für Guanosin bevorzugt, die gewöhnlich durch Ammonolyse (Solvolyse) entfernt werden. Wichtige Phosphatschutzgruppen sind die durch β-Eliminierung abspaltbare β-Cyanoethylgruppe sowie insbesondere chlorsubstituierte Phenylester mit verschiedenen Deblockierungsmöglichkeiten. Es gibt eine Vielzahl bekannter Varianten zur Oligonucleotidsynthese, wobei in der Praxis vorrangig Verfahren benutzt werden, die auf der Phosphotriestermethode basieren. Für diese Methode werden Mononucleotide verwendet, deren Phosphatgruppen durch entsprechende Schutzgruppen so blockiert sind, daß die Knüpfung der Internucleotidbindung zur Ausbildung von Phosphotriestern führt, die wegen der – im Gegensatz zu Phosphodiestern – fehlenden Ladung nicht mehr polar sind, sich gut in unpolaren Solventien lösen und auch keine unerwünschten Reaktionen mit bestimmten Aktivierungsmitteln eingehen. Aktivierungsmittel für die Knüpfung der Internucleotidbindung sind abhängig von der gewählten Synthesestrategie. Für die Triestermethode wird bevorzugt 1-(Mesitylen-sulfonyl)-3-nitrotriazol (MSNT) verwendet. Analog zur Peptidsynthese wird auch die Oligonucleotidsynthese an polymeren Trägern (Festphasensynthese) und mit automatischen, programmgesteuerten Synthesizern (DNA-Synthesizer) durchgeführt. Unter optimalen Bedingungen kann man Oligonucleotide bis zu einer Länge von etwa 200 Basen in einem Stück synthetisieren (Stand Mitte 2000). Ist die gewünschte Sequenz synthetisiert, werden alle Schutzgruppen sowie der polymere Träger abgespalten und das Endprodukt durch verschiedene chromatographische Methoden (Chromatographie) oder Polyacrylamid-Gelelektrophorese gereinigt. Die Bestätigung der Identität des Syntheseprodukts erfolgt in der Regel durch Sequenzierung. Die hergestellten Oligonucleotide stellen Ausgangsprodukte für die Gensynthese dar, finden aber auch für andere molekularbiologische Aufgabenstellungen Verwendung, z.B. als Sonden für die Isolierung von mRNA, als primer für die Sequenzierung von DNA (oder mRNA) und für die Polymerase-Kettenreaktion, als Hybridisierungsproben (Hybridisierung) und Linker-Sequenzen für gentechnische Operationen (Gentechnologie).

M.B.

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