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Lexikon der Biologie: Phasenkontrastmikroskopie

Phasenkontrastmikroskopie, Verfahren der Lichtmikroskopie (Mikroskop) zur kontrastreichen (Kontrast) Darstellung durchsichtiger und ungefärbter Objekte ( vgl. Abb. 1 ), etwa lebender Zellen. Im Gegensatz zu gefärbten Objekten, die einen Großteil des sie durchdringenden Lichts absorbieren (Absorption) und so in der Bildebene ein ihnen gleichendes Licht-Schatten-Muster entstehen lassen, erzeugen farblos durchsichtige Objekte nur geringe, von ihrer Dichte und Dicke (= Brechkraft; Brechungsindex) abhängige relative Phasenverschiebungen (Phase) der sie durchdringenden Lichtwellen. Solche Phasenverschiebungen können nicht unmittelbar wahrgenommen oder registriert werden, durch einen Eingriff in den mikroskopischen Strahlengang jedoch in Intensitätsunterschiede umgewandelt und so zur Erzeugung von Bildkontrast ausgenutzt werden (vgl. unten, vgl. Abb. 2 , vgl. Abb. 3 ). Dabei werden die sehr geringen Phasenänderungen, die das Licht beim Durchqueren des Objekts erfährt, sichtbar gemacht, indem das „direkte“ (nicht gebeugte) Licht gegenüber dem gebeugten (Beugung) durch eine „Phasenplatte“ (z.B. Glas mit kreisförmiger Ätzung) in der Phase verschoben und geschwächt wird. Die Phasenkontrastmikroskopie wurde 1935–1942 von F. Zernike entwickelt und eröffnete vor allem in der biologischen Mikroskopie völlig neue Möglichkeiten zur mikroskopischen Beobachtung lebender Objekte.

Grundprinzip der Phasenkontrastmikroskopie:

Die außerordentlich komplexen wellenoptischen Vorgänge, die der Phasenkontrastmikroskopie zugrundeliegen, sind nur annäherungsweise anschaulich zu beschreiben. – Nach der Abbeschen Abbildungstheorie (Abbe [E.]) entstehen Abbilder durchstrahlter Objekte aufgrund von Interferenz zwischen den primären Beugungsbildern (Beugung) der Lichtquelle, d.h. den Interferenz-Haupt- und -Nebenmaxima der Beugungswellenfronten, die vom Objekt erzeugt werden (Mikroskop). Beugungsnebenmaxima sind jedoch nur deutlich und kontrastreich sichtbar, wenn das Objekt – im einfachsten Fall etwa ein schwarz-weißer Streifenraster – aufgrund unterschiedlicher Licht-Absorption in verschiedenen Objektbereichen ein Licht-Schatten-Muster (Absorptionsmuster) erzeugt, in dessen Dunkelpartien die lichtschwachen Seitenmaxima sich genügend hell abheben (Amplitudenobjekt oder Absorptionsobjekt). Hellt man die dunklen Streifen des Rasters mehr und mehr auf, so nimmt der Bild-Kontrast entsprechend ab. Ersetzt man schließlich die schwarzen Rasteranteile durch glasklar durchsichtige Streifen, die sich nur in ihrer Dicke oder Dichte von den „hellen“ Rasterstreifen unterscheiden (Phasenobjekte) – etwa alternierende Glas- und Plexiglas-Streifen –, so überlagern sich in diesem Falle alle von den verschiedenen Objektpartien hervorgerufenen gleich hellen Beugungsbilder der Lichtquelle zu einer fast kontinuierlich hellen Fläche; es entsteht im weiteren Strahlenverlauf bestenfalls eine flaue, kaum erkennbare und kontrastlose Objektabbildung. Nun erfahren Lichtwellen beim Durchtritt durch ein Medium je nach dessen Dicke oder Dichte eine mehr oder weniger starke Verzögerung, die eine geringe Phasenverschiebung (Phase) der aus verschieden dichten Objektpartien austretenden Lichtanteile zu Folge hat ( vgl. Abb. 1 ). Während diese Phasenverschiebung die große Lichtmenge der vom Objekt erzeugten Beugungshauptmaxima nicht nennenswert verändert, vermag sie sehr wohl die Seitenmaxima selektiv zu beeinflussen. Das das Objekt durchdringende Licht setzt sich primär aus allerlei gegeneinander phasenverschobenen Anteilen zusammen. „Strahlengruppen“, die durch die Phasenverschiebung in unterschiedlich dichten Objektpartien in Gegenphase (180° Gangunterschied) geraten, löschen sich aus. Lichtanteile dagegen, die durch eben diese Objektdichte-bedingte relative Phasenverschiebung das Objekt phasengleich, also ohne Gangunterschied, verlassen, weisen in den seitlichen Beugungsbündeln (Nebenmaxima) eine Phasendifferenz von λ/2 (λ = Wellenlänge) auf und löschen sich ebenfalls aus. In dem Maße, wie die relative Phasenlage der Lichtanteile in den verschieden dichten Objektpartien von einem der beiden vorgenannten Extreme, Phasengleichheit und Gegenphase, abweicht, verringert sich die gegenseitige Abschwächung durch Interferenz, d.h., der geringe Lichtanteil, der von beiden Extremen gleicht weit entfernt ist, dessen Phasenverschiebung also λ/4 beträgt, wird noch ein sehr lichtschwaches seitliches Beugungs-Nebenmaximum ausbilden können. Wegen seiner im Vergleich zum Hauptmaximum geringen Helligkeit und zudem einer Phasenverschiebung gegenüber diesem um λ/4 reicht seine Wechselwirkung mit dem Hauptmaximum jedoch nicht aus, ein kontrastreiches Bild entstehen zu lassen. Gelingt es nun, das Hauptmaximum selektiv zu dämpfen und dieses zugleich um λ/4 zu verschieben, so kommt es zu maximaler Interferenz zwischen Haupt- und Nebenmaximum. Da in der hinteren Brennebene des Objektivs Haupt- und Nebenmaxima mehr oder weniger räumlich getrennt sind, kann man an dieser Stelle durch Einbringen eines sog. Phasenplättchens ( vgl. Abb. 2 ) in den Strahlengang das Hauptmaximum in der gewünschten Weise selektiv verändern, ohne die Nebenmaxima zu beeinträchtigen. Ein solches Phasenplättchen entspricht in Größe, Form und Lage dem Hauptmaximum und besteht entweder aus einer Ausätzung in einer Linsenoberfläche oder Planglasplatte in der hinteren Brennebene des Objektivs, die das Hauptmaximum um λ/4 „beschleunigt“, oder aus einer um den gleichen Betrag verzögernden Verdickung. Im ersten Fall wird die Phasenverschiebung zwischen Haupt- und Nebenmaxima auf λ/2 erhöht und damit im Endbild wieder Phasengleichheit und eine positive Interferenz erreicht; dünne Objektpartien erscheinen gegenüber dicken aufgehellt (positiver Phasenkontrast), während sich im zweiten Fall durch Verzögerung des Hauptmaximums Phasengleichheit zwischen diesem und den Nebenmaxima und somit im Endbild ein umgekehrter, negativer Phasenkontrast ergibt. Durch Aufdampfen einer Filterschicht auf das Phasenplättchen läßt sich das Hauptmaximum zusätzlich noch im erforderlichen Maße dämpfen. Hauptgebot zur Erzielung eines guten Phasenkontrastes ist also eine saubere Trennung bzw. eine geringe Überlappung von Haupt- und Nebenmaxima – eine Bedingung, die bei einer möglichst kleinflächigen Lichtquelle (= geringe Öffnung der Kondensorblende) am ehesten erfüllt wäre – allerdings auf Kosten von Auflösung und Bildhelligkeit. Als praktikabler hat sich bewährt, die Irisblende des Kondensors gegen eine Zentralblende mit einem peripheren Ringspalt auszuwechseln und somit eine ringförmige Kondensoröffnung (= Lichtquelle) zu schaffen. Diese findet dann ihre Entsprechung in einem passend dimensionierten Phasenring im Objektiv. So ist einerseits eine große Leuchtfläche und damit eine ausreichende Lichtmenge gewährleistet, und die möglichen Überlappungsflächen zwischen Haupt- und Nebenmaxima (in diesem Fall nur Schnittflächen der Lichtringe) werden dennoch gering gehalten. Andererseits erlauben die große Kondensoröffnung (= Apertur; Mikroskop) und die rotationssymmetrische Schrägbeleuchtung eine hohe Bildauflösung. Die Phasenringe von Kondensor und Objektiv müssen genau zueinander zentriert und miteinander zur Deckung gebracht werden. Dazu lassen sich die Blenden-Beugungsbilder und der Objektiv-Phasenring entweder nach Entfernen des Okulars durch den leeren Mikroskoptubus oder – besser – durch eine spezielle, gegen das Okular zu vertauschende Phaseneinstell-Lupe, ein sog. Phasen-Hilfsmikroskop, beobachten. Da die Größe der Phasenringe von der Objektivapertur abhängig ist, müssen auch die Phasenblenden im Kondensor jeweils dem Objektiv angepaßt werden. In der Praxis hat es sich bewährt, Revolverkondensoren mit in der Regel 3 verschiedenen starren Phasenblenden zu benutzen, die mit entsprechend bezifferten Phasenkontrast-Objektiven abgestimmt sind und an jedem Mikroskop verwendet werden können. Sie sind gewöhnlich mit einem „Ph“ gekennzeichnet. Zusätzlich enthalten solche Mehrfachkondensoren gewöhnlich noch einen wahlweise einschaltbaren Normalkondensor mit Irisblende, der einen raschen Wechsel zwischen Phasenkontrastmikroskopie und Durchlicht-Hellfeldmikroskopie erlaubt, was zur richtigen Beurteilung von Objektstrukturen oft unerläßlich ist. Die Phasenkontrastmikroskopie eignet sich vornehmlich zur Beobachtung sehr dünner Objekte, da in dicken Objekten alle Strukturen durch Überlagerung verschiedener Bildebenen von störenden Lichthöfen (Halo) umgeben sind. Nomarski-Interferenzkontrastmikroskopie.

P.E.

Lit.: Hansen, H.G., Rominger, A., Michel, K.: Das Phasenkontrastverfahren in der Medizin. Göttingen 1960. Keuning, F.J.: Das Phasenkontrastverfahren in der Mikroskopie – Theoretische Grundlagen und praktische Anwendung. Mikroskopie 5, 49–61 (1950). Zernike, F.: Das Phasenkontrastverfahren bei der mikroskopischen Beobachtung. Z. techn. Physik 16, 454–455 (1935); Phys. Zeitschr. 36, 848–851 (1935).



Phasenkontrastmikroskopie

Abb. 1: Speicheldrüsenchromosom in einer a Hellfeld- und b Phasenkontrastaufnahme



Phasenkontrastmikroskopie

Abb. 2: a
Amplitudenobjekt: durch Absorption wird die Amplitude, jedoch nicht die Phase verändert; I und II interferieren zu „grau“. b Phasenobjekt (Brechzahlunterschied): in einem Medium größerer Brechzahl bleibt die Welle zurück; I und II interferieren zu „dunkel“. c Phasenobjekt (Wegunterschied): In einem dickeren Medium bleibt die Welle zurück, I und II interferieren zu „dunkel“.



Phasenkontrastmikroskopie

Abb. 3:
Strahlengang im Mikroskop; a Bild ohne Ringblende und Phasenplatte, b Bild mit Ringblende und Phasenplatte. Au Auge, Ko Kondensor, Ob Objekt, Obb Objektivbrennpunkt, Ok Okular, Okb Okularbrennpunkt, Ot Objektiv, Pp Phasenplatte, Rb Ringblende

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