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Lexikon der Biologie: Polynucleotid-Kinase

Polynucleotid-Kinase w, T4-Polynucleotid-Kinase, Abk. PNK, ein aus mit dem Phagen T4 (T-Phagen) infizierten Bakterienzellen gereinigtes, phagencodiertes Enzym, das aus 4 identischen Untereinheiten mit einer relativen Molekülmasse von jeweils 33.000 besteht. Es phosphoryliert (Phosphorylierung) durch Übertragung des γ-Phosphatrestes von ATP (Adenosintriphosphat) auf die freien OH-Gruppen die 5'-Enden von DNA, RNA und entsprechenden Oligonucleotiden. Bevorzugte Substrate sind 5'-überhängende Enden (sticky ends) von Nucleinsäuren; glatte (blunt end) oder nach innen versetzte Enden werden sehr viel schlechter phosphoryliert. Die PNK wird häufig bei molekularbiologischen Arbeiten zur radioaktiven Markierung (Endmarkierung von DNA-Fragmenten) von Nucleinsäuren eingesetzt. Bei der radioaktiven Markierung von Nucleinsäuren kann man 2 unterschiedliche Vorgehensweisen unterscheiden:
a) Bei der direkten Phosphorylierung im Rahmen der forward reaction werden direkt radioaktive Phosphatreste von γ-32P-ATP auf die freien 5'-OH-Gruppen von Nucleinsäuren übertragen. Dabei ist zu beachten, daß freie OH-Enden zum Teil durch Vorbehandlung der Nucleinsäuren, d.h. Dephosphorylierung (Abspaltung von bereits vorhandenen Phosphatgruppen z.B. an DNA-Fragmenten nach Verdau mit Restriktionsenzymen) mit alkalischer Phosphatase, erst geschaffen werden müssen.
b) Bei der Austauschreaktion (exchange reaction) wird zu dem γ-32P-ATP ein Überschuß an ADP (Adenosin-5'-diphosphat) gegeben. Das Enzym überträgt dann zunächst den 5'-Phosphatrest der Nucleinsäuren auf ADP und in einem folgenden Schritt radioaktives Phosphat von γ-32P-ATP auf das so vorbereitete (dephosphorylierte) 5'-Ende der Nucleinsäuren. Die Austauschreaktion läuft sehr viel weniger vollständig ab; man kann jedoch hierbei auf eine möglicherweise nötige Dephosphorylierung von 5'-Enden verzichten.

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