Lexikon der Biologie: positional cloning
positional cloning, Positionsklonierung, Bezeichnung für die Strategie zur Kartierung (Genkartierung) und Klonierung von meist krankheitsverursachenden Genen (Erbkrankheiten), ausgehend von der Position (Genort) in der genetischen oder physikalischen Genkarte (Chromosomenkarte [ Chromosomenkarte I
Chromosomenkarte II
Chromosomenkarte III
Chromosomenkarte IV
]). Die frühere Bezeichnung reverse genetics (reverse Genetik) sollte die zum functional cloning gegenteilige Strategie betonen. Die Strategie des positional cloning zur genetischen Analyse von Phänotypen (Erbkrankheiten) gliedert sich in 4 Schritte ( vgl. Abb. ): 1. Charakterisierung der Phänotypen, 2. Kartierung des Gens, 3. Klonierung des Gens, 4. Funktionsbestimmung des Gens. Der Charakterisierung des Phänotyps kommt die größte Bedeutung zu, da von ihr der Erfolg der Kopplungsanalyse zur Bestimmung des Genorts abhängt. Es müssen die Fragen nach einer einheitlichen Entität des Phänotyps, insbesondere die Eliminierung von Phänokopien, geklärt werden. Das zugrundeliegende biologische Modell, mit den Fragen nach den genetischen Komponenten und den Umweltfaktoren, dem Erbgang (monogen, multigen, oligogen, multifaktoriell) sowie der Ausbildungswahrscheinlichkeit, stellt die Grundlage für das angewandte statistische Verfahren in der Kopplungsanalyse dar. Ist das biologische Modell im vorhandenen Stammbaummaterial nicht eindeutig, kann dieses unter der Annahme verschiedener Modelle geordnet und getrennt ausgewertet werden. Die Kartierung des Gens kann im einfachsten Fall, wenn ein cytogenetisch sichtbares Arrangement der Chromosomen vorliegt (Chromosomenaberrationen), auch ohne die Lokalisierung in der genetischen Karte direkt einer chromosomalen Bande zugeordnet werden. Ist dies nicht gegeben (in den meisten Fällen), muß der Genort über eine Kopplungsanalyse mit polymorphen Markern in der genetischen Karte bestimmt werden, um anschließend im Vergleich mit genetisch und physikalich kartierten Loci die Position auf dem Chromosom bestimmen zu können. Die Anwendung von etwa 200–300 polymorphen Markern ermöglicht die Bestimmung desjenigen Haplotyps in dem Familienmaterial, der mit dem analysierten Phänotyp segregiert bzw. die geringste Zahl an Rekombinanten in den Stammbäumen aufweist. Eine Feinkartierung ergibt anschließend einen bestenfalls 1–2 cM (Centimorgan) großen Abstand zwischen einem bekannten Markerlocus und dem Krankheitslocus. In diesem Intervall von etwa 1000–2000 kbp sollte sich das gesuchte Gen befinden. Aufgrund einer Gendichte von etwa 100.000 Genen des Menschen in etwa 3,3 ·109 bp-Sequenzen lassen sich wegen der zum Teil gehäuften Verteilung von Genen in manchen Chromosomenabschnitten etwa 20–40 Gene in diesem Intervall identifizieren. Dieser Schritt basiert auf 3 grundlegenden Eigenschaften von Genen. Gene enthalten in der Evolution (molekulare Evolution) konservierte Sequenzen, sind exprimiert und zeigen einen bestimmten strukturierten Aufbau in der Basenabfolge (Basensequenz). Die Suche nach den Genen setzt die Klonierung der genomischen DNA dieses Intervalls voraus. Dies geschieht am schnellsten durch Isolierung von künstlichen Hefechromosomen (YACs), die klonierte Mensch-DNA enthalten, aus sog. YAC-Bibliotheken. Die Komplexität dieser zwischen 100 und 1000 kbp großen Fragmente macht zunächst einen weiteren Schritt notwendig, durch den man lediglich einmal im Genom vorhandene Sequenzen (single copy) isoliert. Durch Hybridisierungsexperimente von solchen DNA-Fragmenten aus dem kartierten Intervall an geschnittener, genomischer DNA verschiedener Spezies (Mensch, Maus, Rind, Vögel, Fisch, usw.; Zoo-Blot) läßt sich anhand der Intensität und Komplexität des Bandenmusters bestimmen, ob ein Fragment Teile bedeutender und damit konservierter Sequenzen enthält. Die Expression von Genen kann durch Hybridisierung des klonierten Fragments an RNA im Northern-Blot (blotting-Techniken) oder an cDNA-Bibliotheken (Expressionsbibliothek, Genbibliothek) bestimmter Gewebe gezeigt werden. Die strukturellen Eigenschaften von Gensequenzen können zu deren Isolierung über Sequenzsignale, wie Promotoren, poly(A)-Signale, Spleiß-Signale (spleißen) an Exon-Intron-Grenzen benutzt werden (Beispiel: Exon trapping). Mittels Sequenzierung größerer DNA-Abschnitte lassen sich aber auch über Computerprogramme die informellen Strukturen von Genen identifizieren. Gleichzeitig mit der Isolierung von Genen aus dem identifizierten Intervall beginnt die Suche nach mutanten Allelen, die für den beschriebenen Phänotyp verantwortlich sind. Liegt die Ursache in größeren molekularen Deletionen oder Insertionen in dem mutanten Allel für den Funktionsverlust, lassen sich meist veränderte Fragmentgrößen im Southern-Blot von Patienten-DNA nachweisen. Sind Punktmutationen die Ursache für das mutierte Protein, muß der gesamte codierende Bereich des Gens auf Abweichungen von Mutanten-DNA zu Wildtyp-DNA analysiert werden. Hierzu kann der entsprechende DNA-Abschnitt nach Amplifikation mittels PCR (Polymerase-Kettenreaktion) direkt sequenziert oder nach unterschiedlicher Basenzusammensetzung durch spezielle elektrophoretische Verfahren untersucht werden (single-strand conformation polymorphism). An den gefundenen mutanten Allelen muß gezeigt werden, daß sie ursächlich für den beobachteten Phänotyp sind und nicht einen neutralen Polymorphismus darstellen. Der klarste Beweis hierfür ist eine Expression des mutanten Allels in einer transgenen Maus (transgene Tiere), die den beschriebenen Phänotyp liefern sollte. Der letzte Schritt des positional cloning eines Phänotyps ist mit dem funktionellen Studium des Proteins erreicht. Die Analyse der biochemischen Daten führt zur Aufklärung der Genotyp-Phänotyp-Beziehung und zum Verständnis der molekularen Mechanismen der Erkrankung. Genomik.
J.B.-F.
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positional cloning
Schematische Darstellung der positional-cloning-Strategie:
Im ersten Teil der positional-cloning-Strategie wird durch eine Kopplungsanalyse mittels des erhobenen Familienmaterials (DNA aus Blut oder Gewebe) und polymorphen, genetischen Markern (RFLPs, CA-repeats) zunächst eine chromosomale, dann schließlich eine Feinkartierung des Erkrankungslocus bezüglich bekannter Markerloci erreicht. Der Übergang von genetischer Kartierung zu physikalischer Karte erfolgt durch in-situ-Hybridisierung der Marker zu chromosomalen Banden und anschließend mittels Puls-Feld-Gelelektrophorese zu großräumigen Restriktionskarten. Durch das Screening von YAC-Bibliotheken nach Fragmenten aus der Kandidatenregion mit den identifizierten Markern wird der Schritt von der Kartierung zur Klonierung vollzogen. Die erhaltenen YACs (künstliches Hefechromosom) werden nach Genen untersucht und isolierte Gensequenzen von Wildtyp- und Patienten-DNA verglichen. Die gefundenen Mutationen können an DNA anderer Patienten bestätigt oder neue Mutationen in dem entsprechenden Gen gesucht werden.
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