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Lexikon der Biologie: Proteinbestimmung

Proteinbestimmung, Bezeichnung für alle Methoden zur Quantifizierung von Proteinmengen (Proteine). Hierzu wurde eine Reihe verschiedener Techniken entwickelt, die sich jeweils in ihrer Sensitivität und Störempfindlichkeit unterscheiden. Neben der direkten Messung der Absorptionsspektren von Proteinlösungen (Absorptionsspektroskopie) werden meist kolorimetrische Tests (Kolorimetrie) durchgeführt. Hierbei wird die Verfärbung der zu untersuchenden Proteinlösung nach Zugabe von bestimmten Farbstoffen mit der Verfärbung von Eichlösungen bekannter Proteinkonzentration verglichen, wobei meist die genaue Messung der optischen Dichte der Lösungen zugrunde liegt. Bekannte kolorimetrische Methoden zur Proteinbestimmung sind die Biuret-Reaktion, der Bicinchoninsäure-Assay, die Bradford-Methode und die Lowry-Methode.
Bei der Bradford-Methode zur Bestimmung von Proteinkonzentrationen bzw. -mengen wird der Farbstoff Coomassie-Brillantblau G250 (Acid Blue 90) verwendet, der mit Proteinen, vor allem über Wechselwirkungen mit Arginin-Resten, blaue Komplexe bildet. Diese Komplexe besitzen ein Absorptionsmaximum bei einer Wellenlänge von 595 nm. Da die absolute Höhe der Absorption der Komplexe direkt proportional zur Proteinkonzentration in der gemessenen Lösung ist, lassen sich unter Bezugnahme auf Eichlösungen (meist BSA-Lösungen; Rinderserumalbumin) Proteinmengen bestimmen. Die Bradford-Methode eignet sich am besten zur Bestimmung von Proteinmengen im Bereich von 1–10 μg, die Nachweisgrenze liegt bei 0,05–0,5 μg/ml. Die Bildung der gefärbten Protein-Farbstoff-Komplexe kann auch zur Sichtbarmachung von Proteinen in Gelen (Polyacrylamid-Gelelektrophorese,) eingesetzt werden („Färbung von Gelen“).
Die Lowry-Methode (Lowry-Proteinbestimmung, Proteinbestimmung nach Lowry) ist eine mit der Biuret-Reaktion verwandte kolorimetrische Methode zur Bestimmung von Proteinkonzentrationen in Lösungen. Im ersten Schritt wird auch hier ein Kupfer-Protein-Komplex in alkalischer Lösung gebildet. Dieser Komplex reduziert dann ein zugegebenes Phosphomolybdat-Phosphowolframat-Reagens (Folin-Ciocalteau-Phenol-Reagens), wobei auch Cu2+ (Kupfer) im Kupfer-Protein-Komplex zu Cu+ reduziert wird. In Abhängigkeit von der Menge der vorhandenen Proteine verfärbt sich die Lösung intensiv blau. Die Absorption der Lösung kann dann bei einer Wellenlänge von 540, 650 oder 750 nm gemessen und die darin enthaltene Proteinmenge unter Zuhilfenahme einer Eichkurve bestimmt werden. Die Lowry-Methode ist mit einer Nachweisgrenze von 0,1–1 μg/ml wesentlich sensitiver als die Biuret-Reaktion, jedoch auch leichter zu beeinträchtigen, so z.B. durch die Anwesenheit von verschiedenen Reduktionsmitteln. Daher wurde eine Vielzahl von Modifikationen der Lowry-Methode entwickelt, deren Hauptziel es ist, störende Faktoren zu eliminieren bzw. zu kompensieren.
Eine Alternative zur Lowry-Methode stellt der Bicinchoninsäure-Assay (BCA-Assay) dar. Der Assay beruht darauf, daß Cystein, Cystin, Tyrosin, Tryptophan sowie Peptidbindungen unter geeigneten Bedingungen Cu2+ zu Cu+ reduzieren. Cu+ bildet mit Bicinchoninsäure (BCA) einen Farbkomplex mit einem Absorptionsmaximum von 562 nm. Vorteile gegenüber der Lowry-Methode sind die einfachere Durchführung, die z.B. durch Variation der Temperatur beeinflußbare Sensitivität (ansonsten ähnlich der Lowry-Methode) und die höhere Stabilität der gebildeten Farbkomplexe. Allerdings ist auch der BCA-Assay sehr störanfällig. Aminosäurereagenzien.

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