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Lexikon der Biologie: random priming

random priming s, Oligonucleotid-labeling, Polypriming, Feinberg-Vogelstein-Technik, eine von Feinberg und Vogelstein 1986 eingeführte einfache und effiziente Technik zur Markierung von DNA-Molekülen (Desoxyribonucleinsäuren). Es können dabei hohe spezifische Aktivitäten erreicht werden. Die Methode stellt eine Alternative zur nick translation dar. Bei dem random priming ( vgl. Abb. ) wird eine Mischung von chemisch synthetisierten Oligonucleotiden mit einer Länge von ca. 6 oder 7 Nucleotiden eingesetzt. Die Oligonucleotid-Mischung besteht hierbei aus einer Sammlung aller möglichen Basenabfolgen für Hexa- oder Heptamer-Nucleotide. Es ist daher zu erwarten, daß eine zu einem Oligonucleotid aus diesem Gemisch komplementäre Sequenz alle ca. 100 Basenpaare auf einem beliebigen DNA-Stück vorliegt. Wird nun ein solches Oligo-Gemisch mit einem zu markierenden DNA-Fragment zur Hybridisierung gebracht, können statistisch verteilte hybridisierte Oligos als primer für die Neusynthese von DNA durch zuzugebende DNA-Polymerasen oder Klenow-Fragment fungieren. Die eingesetzte DNA dient hierbei als Matrize. Zur Synthese des neuen DNA-Strangs können nun eines oder mehrere der hierbei benötigten 2'-Desoxyribonucleosid-5'-triphosphate als radioaktiv oder mit Digoxigenin markierte Substrate eingesetzt werden. Da so im allgemeinen mehrere markierte Moleküle in den neuen Strang eingebaut werden, können z.B. bei radioaktiver Markierung spezifische Aktivitäten von bis zu über 109 cpm/μg DNA erreicht werden, was die Effizienz der nick translation noch übertrifft. Zudem besitzt das random priming den Vorteil, daß keine DNase-Behandlung (Desoxyribonuclease) der zu markierenden DNA und anschließende Reinigung erforderlich sind. Man muß jedoch beachten, daß durch random priming markierte DNA aufgrund der oben beschriebenen Vorgehensweise in ihrer schließlich erhaltenen Länge unter Umständen nicht ganz homogen ist, da die 5'-Enden des markierten Strangs oft nicht genau mit dem 3'-Ende des template-Strangs übereinstimmen. Die dadurch überhängenden 3'-Enden können andererseits jedoch auch durch die 3'→5'-Exonuclease-Aktivität (Exonucleasen) der DNA-Polymerasen abgebaut werden, wodurch in den meisten Fällen recht homogene, unter Umständen im Vergleich zum Originalfragment aber etwas verkürzte DNA-Moleküle entstehen.



random priming

Vorgehensweise bei dem random priming: Zu markierende DNA wird nach Denaturierung mit einem Oligonucleotid-Gemisch hybridisiert. Von diesen Startstellen aus können DNA-Polymerasen unter Einbau markierter dNTPs einen neuen Strang synthetisieren, der vollständig durchmarkiert ist.

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