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Lexikon der Biologie: recognition site screening

recognition site screening s, South-Western-Screening, eine Methode zur Suche von Genen für an spezifische DNA-Sequenzen bindende Faktoren (Transkriptionsfaktoren, HMG-Proteine) in Genbibliotheken. Bei dieser Technik wird die Eigenschaft von spezifisch DNA bindenden Faktoren genutzt, genau definierte DNA-Sequenzabschnitte zu binden, andere Sequenzen hingegen nicht zu berücksichtigen (wie es auch bei der South-Western Technik erfolgt; blotting-Techniken.). Man geht von einer Expressionsbibliothek aus und induziert (Induktion, Isopropyl-β-thiogalactosid) die Synthese von Fusionsproteinen. Nach Transfer der zu untersuchenden Phagen-Plaques der Bibliothek mit den von den Wirtsbakterien synthetisierten Fusionsproteinen auf geeignete Membranfilter werden diese nach gewissen Vorbehandlungen mit einem markierten spezifischen DNA-Abschnitt in Gegenwart eines Überschusses unspezifischer Carrier-DNA (z.B. Kalbsthymus-DNA) inkubiert. Die spezifische DNA beinhaltet die Erkennungs- bzw. Zielsequenzen (recognition sites, target sites; Erkennungsstellen) für diejenigen Faktoren, deren Gene aus der Bibliothek isoliert werden sollen und deren Bindeeigenschaften an DNA meist schon durch band shift-Analysen (band shift) oder footprint-Studien (footprint) bekannt sind. Die Fusionsproteine, die spezifisch an die angebotene Zielsequenz binden, sind durch Nachweis der Markierung der DNA (Autoradiographie der Membranfilter bei radioaktiver Markierung oder Nachweis nichtradioaktiver Markierungen, z.B. des Digoxigenins) auf den Filtern lokalisierbar, und die ihnen zugrundeliegenden rekombinanten Bakteriophagen können dann auf den entsprechenden Agarplatten aufgefunden werden. Die in den Phagen enthaltenen Genstrukturen der DNA-bindenden Faktoren können schließlich für weitere Studien isoliert werden.

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