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Lexikon der Optik: mikroskopische Präpariertechnik

mikroskopische Präpariertechnik, die Technik zur Herstellung lichtmikroskopischer Präparate.

1) Frische Präparate. Diese werden in indifferente Zusatzflüssigkeiten gebracht. Natürliche Zusatzflüssigkeiten sind körpereigene Flüssigkeiten wie Augenkammerwasser, Amnionwasser, Blutserum, Blutplasma und Lymphe. Künstliche Zusatzflüssigkeiten sind physiologische Kochsalzlösung, Ringerlösung sowie Tyrodelösung.

2) Lebende Präparate. Damit sind Präparate gemeint, die charakteristische Lebensäußerungen zeigen (Bakterien, lebende Zellen und Gewebe). Sie werden folgendermaßen behandelt:

a) Reinkulturen von Bakterien können auf synthetischen Nährlösungen mit wachstumshemmenden oder wachstumsfördernden Zusätzen auf Objektträgern untersucht werden. Wachstum und Selektion von Bakterien werden auf festen Nährböden (Gelatine oder Agarnährböden) untersucht. Die direkte mikroskopische Beobachtung lebender Objekte im Phasenkontrast geschieht im Deckglasagarpräparat.

b) Lebendes Gewebe im unversehrten Verband des Organismus kann mit Hilfe der Auflichtmikroskopie untersucht werden, z.B. mit der Hornhautmikroskopie bei der Augenuntersuchung oder der Fluoreszenzmikroskopie nach Injektion eines Fluoreszenzfarbstoffes in die Haut oder Blutbahn eines narkotisierten Tieres.

c) Lebendes Gewebe außerhalb des Gewebeverbandes wird mit Hilfe der Gewebezüchtung oder Explantation in einem geeigneten Medium am Leben erhalten und weitergezüchtet. Zur Untersuchung von Gewebekulturen im Mikroskop verwendet man Mikroskop-Thermostaten oder elektrische Heiztische, für langdauernde Beobachtungen auch Durchflußkammern.

3) Fixierung. Darunter versteht man die rasche Überführung eines Lebewesens oder von Teilen eines solchen in einen dem lebenden möglichst gleichenden dauerhaften Zustand. Die Fixierung kann durch trockene oder feuchte Hitze und durch chemische Reagenzien herbeigeführt werden. Chemische Fixierung erfolgt bei Gewebestückchen durch Fixierungsflüssigkeiten wie Alkohol, Formaldehyd, Osmiumtetroxid, Essig- und Pikrinsäure, Kaliumdichromat, Sublimat, Trichloressigsäure und Uranylacetat.

4) Entwässerung (Dehydrierung). Um die fixierten Präparate zu entwässern, verwendet man Alkohol oder Dioxanreihen. Organe, die Kalk enthalten, müssen nach der Fixierung mit 5%iger Salpetersäure entkalkt werden (Knochen, Zähne). Von Knochen und Zahnschmelz lassen sich ähnlich wie von Gesteinsproben dünne Schliffe herstellen.

5) Einbettung. Um Objekte zu schneiden, müssen sie in der Regel mit einer widerstandsfähigen, gut schneidbaren Masse durchtränkt werden. Gebräuchlich sind in der allgemeinen Histologie Paraffin, Zelloidin und Gelatine, in der Ultrastrukturforschung z.B. Butyl- und Methylmethacrylat (flüssige Monomere von Plexiglas), Araldit, Plexigum und Vestopal.

6) Schneiden. Hierfür benutzt man mit speziellen Messern ausgestattete Schneideapparaturen, die sogenannten Mikrotome.

7) Befestigen der Schnitte auf Objektträgern. Paraffinschnitte überträgt man mit einem Pinsel auf gut gereinigte Glasobjektträger und klebt sie dort unter Verwendung von aqua dest. oder Eiweißglycerinlösung auf.

8) Färbung histologischer Präparate. Sie ist ein Hilfsmittel zur leichteren Erkennung von Zellen und Geweben und deren Struktur bei der mikroskopischen Untersuchung. Die Färbungen kommen auf verschiedene Weise zustande und werden nach einer großen Zahl von Rezepten ausgeführt.

a) Verwendet werden natürliche Farbstoffe organischer Verbindungen, z.B. Karmin von der Cochenillelaus, Hämatoxylin vom amerikanischen Blauholz, Orcein von der Flechte Rocella und künstliche Anilinfarbstoffe, welche in saure und basische Farbstoffe unterschieden werden. Basische Farbstoffe sind z.B. Fuchsin, Gentianaviolett, Methylenblau, Methylengrün, Thionin und Toluidinblau. Mit diesen Farbstoffen werden saure, daher basophile Elemente, vor allem das Chromatin der Kerne, manche Granula, Schleim, Knorpel sowie Nervenelemente zur Darstellung gebracht. Saure Farbstoffe sind z.B. Eosin, Erythrosin, Lichtgrün, Orange, Pikrinsäure und Säurefuchsin. Sie färben basische, somit acidophile Bestandteile, wie das Zytoplasma, ferner Kernkörperchen, kollagene Fasern usw. Des weiteren finden neutrale Farbstoffe wie eosinsaures Methylenblau, Triacid-Gemisch (Methylgrün-Säurefuchsin-Orange) und die indifferenten Farbstoffe Sudan III und Scharlachrot Verwendung, letztere für die Färbung von Fettsubstanzen.

b) Die histologische Färbung kann progressiv oder regressiv durchgeführt werden. Unter progressiver Färbung versteht man das Anfärben des Schnittes in verdünnter Farblösung ohne Nachbehandlung, bis der erwünschte Farbgrad erreicht ist. Regressive Färbung erfolgt durch eine Überfärbung mit starken Farblösungen und nachfolgender Farbentfernung durch Differenzieren mittels geeigneter Lösungsmittel.

c) Färben sich Objekte unmittelbar aus einer Farblösung ohne weitere Vorbehandlung an, spricht man von einer substantiven (direkten) Färbung; ist eine Vorbehandlung mit einem anderen Stoff notwendig (Beizung), spricht man von adjektiver (indirekter) Färbung. Mehrfachfärbungen werden durch bestimmte Farbzusammensetzungen erzielt. Als Vitalfärbung bezeichnet man eine Färbetechnik, mit deren Hilfe Organismen und Zellen ohne tiefgreifende Störung der Lebensfunktion angefärbt werden, so daß Beobachtungen zytologischer Einzelheiten im lebenden Zustand (intra vitam) möglich sind. Zur Vitalfluorochromierung verwendet man Fluorochrome. Das sind Farbstoffe, die einem nichtfluoreszierenden Objekt die Eigenschaft der Fluoreszenz erteilen (sekundäre Fluoreszenz). Man unterscheidet: katodische Fluorochrome wie Auramin, Berberinsulfat, Pyronin, Acridinorange, bei denen die Kationen die Träger der Fluoreszenzerscheinungen sind, anodische Fluorochrome wie z.B. Primulin, deren fluoreszierender Anteil in dissoziiertem Zustande die Anionen sind, und elektroneutrale (lipophile) Fluorochrome wie z.B. Rhodamin B. Die Fluorochromierung ist in geringen Konzentrationen (1:20000) unschädlich und im Fluoreszenzmikroskop voll wirksam.

9) Einschlußmittel für Dauerpräparate. Diese müssen durchsichtig sein und dürfen Struktur und Farbe des Präparates nicht angreifen. Mit Wasser mischbare Einschlußmittel (Glycerin, Gummisirup, Lävulose, Gelatine) können ohne vorherige Entwässerung der Präparate verwendet werden. Vollkommene Entwässerung in Alkoholreihen und Entfernung des Alkohols in Xylol oder Toluol ist erforderlich, wenn als Einschlußmittel Harze oder Öle benutzt werden. Als Einschlußmittel finden Verwendung: Caedax, ein synthetisches Mittel vom Brechungsindex 1,55, Kanadabalsam, ein flüssiges Harz vom Brechungsindex 1,541 bis 1,547, eingedicktes Zedernöl vom Brechungsindex 1,515 sowie Paraffinum liquidum vom Brechungsindex 1,482. Präparate mit wäßrigen Einschlußmitteln erhalten eine Umrandung aus Kanadabalsam, Emaillelack, Bernsteinlack, Celluloid oder Kaliumdichromat-Gelatine.

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