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Arzneimittel aus Erbsubstanz: Antisense- und Triplex-DNA

Kurze synthetische DNA-Stücke können die Herstellung eines pathogenen Proteins, wie es etwa eine virusbefallene oder entartete Zelle erzeugt, verhindern, indem sie Abschrift oder Übersetzung der entsprechenden genetischen Information blockieren. Die ersten befinden sich gerade in der Erprobung.

Wer sich mit der Entwicklung von Medikamenten befaßt, träumt von der Entdeckung eines Wirkstoffs, der eine Krankheit ohne Nebenwirkungen zu heilen vermag. Unfehlbar wie eine "Zauberkugel" sollte er allein das vorbestimmte Ziel treffen – dieses Bild beschwor schon der deutsche Chemiker und Mediziner Paul Ehrlich (1854 bis 1915), der Begründer der wissenschaftlichen Chemotherapie zur Behandlung von Infektionskrankheiten.

Um diesen Traum zu verwirklichen, haben Forscher in unserem Jahrhundert vor allem nach Substanzen gefahndet, die jeweils ein an einem Krankheitsgeschehen beteiligtes Protein an seiner kritischen Stelle besetzen und blockieren könnten. Als Ziel in Frage kamen beispielsweise Moleküle von Erregern oder auch fehlgesteuerte Produkte des eigenen Körpers. Da sich die aktiven Zentren verschiedener Proteine strukturell unterscheiden, sollte sich so nur das anvisierte Protein ausschalten lassen, ohne daß die Funktion anderer physiologisch wichtiger Eiweißstoffe beeinträchtigt würde.

Ein faszinierendes zweites Konzept ist in den vergangenen Jahren hinzugekommen. Auf der Basis sogenannter Antisense- und Triplex-Strategien sucht man Wirkstoffe zu entwickeln, die sich nicht an das pathogene Protein selbst, sondern an bestimmte Abschnitte seiner molekularen Bauanleitung binden, also an das entsprechende Stück der Erbsubstanz DNA oder der davon abgeschriebenen Boten-RNA (einer der Desoxyribonucleinsäure ähnlichen Ribonucleinsäure; das A steht für Englisch acid, Säure). Das Konzept ist einleuchtend: Ein schädliches Agens schaltet man am sinnvollsten dadurch aus, daß man von vornherein seine Herstellung unterbindet (Spektrum der Wissenschaft, März 1990, Seite 34).

Die Protein-Biosynthese verläuft in zwei Schritten. Zunächst wird der codierende Abschnitt auf einem der beiden DNA-Stränge in Kopien aus einzelsträngiger Boten-RNA umgeschrieben (transkribiert), die an die Synthesemaschinerie der Zellen gehen. Dort wird die verschlüsselte Information übersetzt (translatiert), das heißt, gemäß ihrer Anweisung eine Reihe von Aminosäuren zum Protein verkettet. Es gilt also, auf der Ebene der Transkription oder der Translation gezielt einzugreifen (Bild 1).

Die dafür vorgesehenen Wirkstoffe sind ihrerseits Nucleinsäuren. Am besten untersucht sind DNA-Oligonucleotide: kurze synthetische Einzelketten aus im Prinzip den gleichen Grundbausteinen wie natürliche DNA. Da es sich um Polymere von nur wenigen (griechisch oligoi) Nucleotiden Länge handelt, spricht man auch von DNA-Oligomeren.

Solche Verbindungen sind unter anderem deswegen Mittel der Wahl, weil Nucleinsäure-Moleküle sich nach klaren bekannten Regeln aneinanderlagern. Ihre Bausteine, eben die Nucleotide, bestehen aus einem Zuckermolekül – Ribose bei RNA, Desoxyribose bei DNA – mit einer Phosphatgruppe und einer von vier stickstoffhaltigen Basen: Adenin (A), Guanin (G), Cytosin (C) oder Uracil (U) bei der RNA beziehungsweise Thymin (T) bei der DNA. In einem Nucleinsäuremolekül sind die Zucker- und Phosphateinheiten gerichtet zu einer Art Rückgrat verkettet, an dem die Stickstoffbasen wie Rippen seitlich abstehen. Bei der Zusammenlagerung zweier Moleküle zu einem Doppelstrang (beide Stränge liegen dann gegenläufig aneinander) müssen passende Basen sich gegenüberstehen, um Wasserstoffbrücken auszubilden. Ein Adenin auf dem einen Strang bildet nur mit Thymin beziehungsweise Uracil auf dem anderen ein Paar und entsprechend Guanin nur mit Cytosin.

Ein einsträngiges DNA-Oligonucleotid etwa mit der Basensequenz ATCCGTG könnte sich deshalb an einen einsträngigen Abschnitt mit der komplementären Sequenz binden: TAGGCAC im Falle der DNA oder UAGGCAC im Falle von RNA (wobei der Anfang der komplementären Stränge hier rechts läge; das gleiche gilt für ein RNA-Oligonucleotid der – analogen – Sequenz AUCCGUG). Unter gewissen Bedingungen sind aber auch Dreifachstränge möglich. Nach diesem Prinzip lassen sich synthetische Oligomere entwerfen, die eine bestimmte Stelle auf einem ausgewählten Gen oder dessen Boten-RNA erkennen. Sie könnten die Spezifität einer "Zauberkugel" erreichen.

Den Ansatz, beide DNA-Stränge eines Gens, die zu einer Doppelhelix umeinander gewunden sind, mit einem drit- ten Strangstück zu blockieren, bezeichnet man als Triplex-Strategie. Sie greift auf der Ebene der Transkription. Von Antisense-Strategie spricht man, wenn das gewissermaßen sinntragende Boten-RNA-Molekül durch einen passenden Gegen-Strang, einen quasi mit Anti-Sinn (englisch antisense), abgedeckt wird. Dies verhindert eine Translation.

Noch sind freilich etliche Hürden bis zum Routine-Einsatz von Triplex- und Antisense-Medikamenten zu überwinden. Dennoch ist Zuversicht angebracht. Einige Konstrukte scheinen bereits vielversprechend genug, um klinische Prüfungen zu rechtfertigen; sie werden derzeit an Patienten mit Leukämie, AIDS und anderen Krankheiten, die verbesserte Therapieansätze erfordern, getestet.

Da solche Oligonucleotide so etwas wie Schnipsel genetischen Materials sind, bezeichnet man sie oft als genetische Therapeutika. Die Assoziation zur Gentherapie drängt sich zwar auf, das Prinzip ist dort aber ein völlig anderes. Bei der Gentherapie von angeborenen Defekten geht es zumeist darum, als Ersatz für ein fehlendes oder funktionsunfähiges Gen gesunde Versionen in die beeinträchtigten Zellen einzuschleusen, damit sie das gewünschte Protein erzeugen können. Oligonucleotide hingegen vermögen nicht als Matrize zur Herstellung von Proteinen zu dienen. Im Gegenteil, ihre Aufgabe ist gerade, die Ausprägung eines bereits vorhandenen Gens, die Expression, zu verhindern.


Gegenmoleküle für RNA

Als erste unter den neuen genetischen Pharmaka haben Antisense-Oligomere das Stadium klinischer Prüfung erreicht. Einer der frühesten Hinweise, daß sie von therapeutischem Nutzen sein könnten, kam Anfang der achtziger Jahre, als in bestimmten Mikroorganismen neben normaler Boten-RNA auch Antisense-RNA entdeckt wurde. Die logischste Erklärung für die natürliche Produktion solcher Moleküle schien zu sein, daß man es mit einem zuvor unbekannten Mechanismus zur Regulation der Genexpression zu tun hatte; denn wenn die Antisense-RNA sich der ihr komplementären Boten-RNA anlagert, würde die Translationsmaschinerie vermutlich nicht mehr richtig darauf zugreifen und das entsprechende Protein produzieren können.

Inzwischen weiß man, daß auch Zellen höherer Organismen diesen Regulationsmechanismus manchmal nutzen. Damals aber mußte erst einmal geprüft werden, ob die Hypothese, es handele sich bei ihm um einen solchen, überhaupt korrekt war. Mit gentechnischen Methoden stellten Wissenschaftler Antisense-Gene her, die nach Einschleusung in die Zelle und Transkription eine Antisense-Version bestimmter Boten-RNAs liefern sollten. Tatsächlich gelang es bei derart manipulierten Zellen manchmal, die Produktion des Proteins, dessen Synthesevorschrift in der anvisierten Boten-RNA verschlüsselt war, zu drosseln.

Für eine breite Anwendung dieses Prinzips müßten Antisense-Pharmaka allerdings einfach und effizient in Zellen im Körper einzuschleusen sein. Die in den meisten Fällen beste Lösung wäre deshalb, kurze Antisense-Oligonucleotide zu verwenden statt ganze, schwierig zu handhabende Antisense-Gene (wenn auch manche Forscher diesen Ansatz weiterverfolgen).

Möglichkeiten, DNA-Oligonucleotide leicht und in hinreichender Menge herzustellen, waren zwar um die Mitte der achtziger Jahre gegeben. Doch ob die Moleküle selbst überhaupt als Medikamente genutzt werden könnten, war offen. Für ihre prinzipielle Wirksamkeit gab es immerhin seit 1978 einen Hinweis. Paul C. Zamecnik von der Worcester-Stiftung für experimentelle Biologie in Shrewsbury (Massachusetts) und Mary L. Stephenson von der Harvard-Universität in Cambridge (Massachusetts) hatten in damals noch mühsamer Arbeit ein Oligomer aus dreizehn Nucleotiden hergestellt, und zwar passend zu einer bestimmten Sequenz, die in mehreren Boten-RNA-Molekülen des Rous-Sarkom-Virus vorkommt (dieses kann bei Hühnern Tumoren induzieren). Die Vermehrung des Erregers in Zellkulturen war nach Gabe des Oligomers gehemmt – ein Indiz dafür, daß dieses die Synthese von Proteinen blockiert hatte, die für den Aufbau neuer Viruspartikel erforderlich sind.

Hinsichtlich der therapeutischen Anwendbarkeit von unmodifizierten Oligonucleotiden hatten die meisten Forscher jedoch ihre Zweifel. Zum einen trägt jede der Phosphatgruppen eine negative Ladung. Geladene Moleküle diffundieren aber nur schlecht durch die ungeladene äußere Lipidmembran einer Zelle. Somit war anzunehmen, daß Standard-Oligonucleotide mit ihren vielen Ladungen nicht effektiv genug an ihre Zielorte gelangen könnten. Zum anderen enthält eine Zelle reichlich Enzyme, die fremde DNA abbauen. Wenn also ein Oligomer-Molekül tatsächlich die Zellmembran passieren sollte, würde es wahrscheinlich zumeist sogleich zerlegt werden.

Diese Probleme ging eine Gruppe um Paul O.P. Ts'o und Paul S. Miller an der Johns-Hopkins-Universität in Baltimore (Maryland) durch chemische Modifikation der Standard-Oligonucleotide an. Zum Beispiel ersetzten sie ein Sauerstoffatom jeder Phosphatgruppe durch eine neutrale Methylgruppe (-CH3); solche Methylphosphonat-Gruppen sind dann ungeladen (Bild 2 unten). Das erleichterte die Aufnahme der Oligomere ins Zellinnere und machte die Moleküle gleichzeitig widerstandsfähig gegen abbauende Enzyme. Andererseits wurden sie durch die Modifikation aber auch hydrophob, also schlecht wasserlöslich, was für einen Herstellungsprozeß im großen Maßstab ungünstig ist.

Eine Alternative fanden später Kazuo Shinozuka und Gerald Zon von der amerikanischen Nahrungs- und Arzneimittelbehörde gemeinsam mit einem von uns (Cohen), damals am Nationalen Krebsforschungsinstitut der USA in Bethesda (Maryland). Statt gegen eine neutrale Methylgruppe tauschten sie ein Phosphat-Sauerstoffatom gegen ein negativ geladenes Schwefelatom aus. Diese Phosphorothioat-Oligonucleotide – kurz S-Oligos genannt – bleiben wasserlöslich, lassen sich leicht automatisiert herstellen und sind ebenfalls resistent gegen Enzyme. Vielleicht sind sie deshalb das heute meistverwendete Material in der Antisense-Arzneimittelforschung.

Wie inzwischen auch klar ist, werden S-Oligos und ihre unmodifizierten Pendants leichter als ursprünglich gedacht von Zellen aufgenommen. Diese geladenen Moleküle sind anscheinend nicht ausschließlich auf die Diffusion durch die Zellmembran angewiesen, sondern werden auch durch Endocytose eingeschleust. Dabei umschließt ein kleiner, sich eindellender Bereich der Zellmembran die aufzunehmenden Stoffe und schnürt sich nach innen zu einem Bläschen ab, das als sogenanntes Endosom weiter ins Zellplasma wandert. Ob der Inhalt ohne weiteres dorthin freigesetzt wird, ist allerdings weniger klar.

Einige der anfänglichen Hindernisse für die therapeutische Verwendbarkeit von Antisense-Oligonucleotiden sind somit kleiner geworden. Forschungen der letzten anderthalb Jahrzehnte haben zudem eine Reihe weiterer wichtiger Faktoren aufgedeckt, die bei der Entwicklung von Antisense-Wirkstoffen zu berücksichtigen sind. Zum Beispiel müssen Oligomere aus mindestens 15 Nucleotiden bestehen, damit sie sich spezifisch und fest an ihre Zielsequenz binden. (Je kürzer eine Sequenz ist, desto höher ist die statistische Wahrscheinlichkeit, daß sie mehrfach auftritt, etwa in anderen Boten-RNA-Molekülen.)

Des weiteren ist inzwischen geklärt, auf welche Weise DNA-Oligomere die Translation unterbinden. Zum einen behindert ihre Anlagerung, wie vorausgesagt, das Ablesen der Boten-RNA-Information. Zum anderen kann sie ein spezielles Enzym – die Ribonuclease H – veranlassen, den besetzten RNA-Strang abzubauen (das Enzym spaltet spezifisch die RNA in einem gemischten Doppelstrang mit DNA; Bild 4 rechts).


Klinische Versuche

All diese Erkenntnisse nähren die Zuversicht, daß die Antisense-Strategie therapeutisch erfolgversprechend ist. Wie steht es aber konkret? Nicht nur Experimente an kultivierten Zellen, sondern auch vorläufige Ergebnisse von Prüfungen am Menschen deuten darauf hin, daß Antisense-DNA wirklich die Synthese krankheitsbeteiligter Proteine zu drosseln vermag (sämtliche klinischen Prüfungen laufen unseres Wissens nach mit S-Oligos).

Berichte verschiedener Laboratorien zeigen zudem, daß Antisense-Wirkstoffe im Tierexperiment kaum bis gar nicht toxisch wirken. Dies ist deshalb erfreulich, weil man in Zellkulturen festgestellt hatte, daß sich S-Oligos häufig auch an Proteine oder andere nicht vorgesehene Ziele binden. Manchmal kann diese unspezifische Anheftung die gewünschte Wirkung sogar verstärken, indem sie die Translation indirekt hemmt. Die Möglichkeit unerwünschter Folgen ist aber stets zu bedenken.

Das erste marktreife Antisense-Medikament wird voraussichtlich eines gegen Viren sein. Das Unternehmen ISIS Pharmaceuticals im kalifornischen Carlsbad führt derzeit einen klinischen Großversuch mit einem Oligonucleotid gegen das menschliche Papillomavirus durch, das Warzen und andere Wucherungen im Genitalbereich verursacht. Das Oligomer richtet sich gegen RNA-Abschriften eines viralen Gens, das für die Vermehrung des Erregers wichtig ist. Nach Injektionen in die befallenen Hautstellen verschwinden den Berichten zufolge die Wucherungen oder werden zumindest kleiner.

In einer früheren Phase befindet sich eine klinische Studie an Patienten, die mit dem AIDS-Erreger, dem Human- Immunschwäche-Virus (HIV), infiziert sind. Wissenschaftler der französischen Nationalbehörde für AIDS-Forschung (Agence Nationale de Recherche sur le SIDA) in Paris, der Firma Hybridon in Worcester (Massachusetts) sowie an anderen Institutionen prüfen dabei ein Oligonucleotid gegen die Boten-RNA des gag-Gens von HIV, dessen Produkt für die Vermehrung des Erregers nötig ist.

Auch in der Krebsbekämpfung beginnen klinische Tests, einer davon an Patienten mit akuter myeloischer Leukämie. Dieser rasch fortschreitende Blutkrebs ist die zweithäufigste Leukämieform bei Kindern und hat seinen Ursprung in den blutbildenden Zellen des Knochenmarks. Ein Forscherteam am Medizinischen Zentrum der Universität von Nebraska in Lincoln untersucht in Zusammenarbeit mit Wissenschaftlern der in Hayward (Kalifornien) ansässigen Firma Lynx Therapeutics, ob ein bestimmtes Antisense-Oligonucleotid Krebszellen direkt im Körper sowie in entnommenem, zu reinigendem Knochenmark zerstören kann. Bei einer solchen externen Behandlung sucht man in dem in Kultur genommenen Material Krebszellen selektiv abzutöten; währenddessen erhält der Patient eine hochdosierte Chemotherapie, die auch gesunde Zellen seines verbliebenen Knochenmarks zerstört. Anschließend wird ihm das von Krebszellen gereinigte Knochenmark aus der Kultur wieder implantiert.

Das in dieser Studie verwendete Antisense-Oligomer richtet sich gegen die Boten-RNA des Gens für das Protein p53. Dieses gilt sonst gerade als Tumorsuppressor. Bei Patienten mit akuter myeloischer Leukämie wird das Gen jedoch offenbar überexprimiert.

Ferner prüft Lynx Therapeutics in Zusammenarbeit mit Alan M. Gewirtz von der Universität von Pennsylvania in Philadelphia ein Antisense-Oligomer zur Behandlung der chronischen myeloischen Leukämie (Bild 5). Es richtet sich gegen die Boten-RNA des Gens c-myb, das in seiner gesunden Form unter anderem die Vermehrung von Blutzellen reguliert. Eine Fehlsteuerung dieses Gens ist an der Entstehung menschlicher Leukämien und anderer Erkrankungen beteiligt. Bisher wurde der Nutzen des Oligomers ebenfalls bei der externen Knochenmarksreinigung geprüft; Gewirtz beginnt inzwischen aber auch, die Wirksamkeit von Antisense-Infusionen direkt an Patienten zu testen.

Für Oligomere gegen weitere Virus- und Krebsgene sind klinische Versuche geplant oder bereits angelaufen. Doch selbst bei positivem Ausgang wird man solche Antisense-Wirkstoffe wohl auf lange Sicht in Kombination mit anderen Medikamenten verabreichen. Zwei oder mehr Wirkstoffe zugleich mit jeweils unterschiedlichen Angriffsmechanismen sind vermutlich schlagkräftiger als jeder fur sich allein.

Wie meist bei neuen Strategien sind noch viele Schwierigkeiten zu meistern, bevor sich das vielversprechende Potential des Antisense-Konzepts voll ausschöpfen läßt. Zum Beispiel sind Oligonucleotide in der Herstellung noch teuer (die Kosten sinken allerdings), und ihre Stabilität läßt zu wünschen übrig. Auch müssen bessere Methoden gefunden werden, sie in ausreichenden Mengen den Zellen zuzuführen. (Bei der Triplex-Strategie, auf die wir gleich näher eingehen, hat man mit denselben Problemen zu kämpfen.) Ferner muß die Wirksamkeit verstärkt werden.

Einige Forscher koppeln dazu RNA-abbauende Moleküle an die Oligomere. Einen anderen Ansatz verfolgen Claude Hélène und seine Mitarbeiter am Nationalmuseum für Naturgeschichte in Paris. Sie statten Oligomere mit chemischen Gruppen aus, die sich zwischen zwei aufeinander folgende Basenpaare des entstehenden RNA-DNA-Doppelstrangs einschieben können. Dies sollte die Bindung des DNA-Oligomers an die RNA stabilisieren und somit seine Wirkungszeit verlängern. Mehrere Arbeitsgruppen, darunter die von mir (Cohen), entwerfen und modellieren am Bildschirm Oligonucleotide mit neuartigen Rückgratstrukturen – in der Hoffnung, wirksamere und zielgenauere zu finden.

Ein völlig anderer Ansatz zur Ausschaltung von Boten-RNA zeitigt inzwischen ebenfalls beeindruckende Fortschritte: Statt auf DNA-Oligomere setzt man dabei auf RNA-Moleküle mit enzymatischen Eigenschaften, sogenannte Ribozyme. Sie erkennen bestimmte Basensequenzen in einer Boten-RNA und zerschneiden sie dort. Flossie Wong-Staal von der Universität von Kalifornien in San Diego will innerhalb der nächsten Monate einen klinischen Test mit einem Ribozym beginnen, das sich gegen die Boten-RNA eines bestimmten Gens von HIV richtet.

Dreifachstränge

Der zweite therapeutische Ansatz auf der Basis von Oligonucleotiden, die Triplex-Strategie, wurde bis vor einiger Zeit weniger stark beachtet, obwohl man Dreifachstränge seit langem kennt. Bereits 1957, vier Jahre nach der Entdeckung der Doppelhelix-Struktur der DNA durch James D. Watson und Francis Crick, waren zwei Nachwuchswissenschaftler an den Nationalen Gesundheitsinstituten der USA in Bethesda (Maryland) darauf gestoßen: Gary Felsenfeld und Alexander Rich synthetisierten für ihre beabsichtigten Strukturuntersuchungen RNA-Polymere zum einen aus Uracil- und zum anderen aus komplementären Adenin-Nucleotiden. Nach Vermischung erhielten sie, wie erwartet, Doppelstränge aus Poly-A und Poly-U (A:U-Doppelstränge). Zu ihrer Überraschung fanden sie jedoch außerdem U:A:U-Dreifachstränge: Ein zusätzlicher U-Strang hatte sich an die reguläre A:U-Doppelhelix geheftet.

Gleiches tun entsprechende DNA- Polymere, wie andere Wissenschaftler anschließend feststellten: Poly-A- und Poly-T-Stränge ließen sich zu T:A:T-Dreifachhelices vereinigen (Bild 3 unten). Richard A. Morgan und Robert D. Wells, damals an der Universität von Wisconsin in Madison, brachten auch einen Poly-C-Strang dazu, sich mit einer G:C-Doppelhelix zu vereinigen – allerdings nur dann, wenn sich die Moleküle in leicht saurer Lösung befanden. Der Extra-Strang aus Poly-C muß nämlich erst positiv geladene Wasserstoff-Ionen (Protonen) einlagern, und die gibt es im Überschuß nur in sauren Lösungen. Die entstehende DNA-Struktur wird als C+:G:C-Triplex bezeichnet.

Jahrelang wurden solche Konfigurationen als bloße Kuriositäten angesehen, durchaus faszinierend zwar, aber ohne erkennbare biologische Relevanz. Daß man über diese Triplex-Strukturen in die Regulation von Genen eingreifen könne, schien ausgeschlossen; schließlich bestehen natürliche Gene nicht aus einfachen Homopolymeren, in denen sich dasselbe Nucleotid in einem Strang bis ans Ende wiederholt: Ein synthetisches Molekül müßte eine gemischte Abfolge von Basenpaaren erkennen können, um von praktischem Nutzen zu sein.

Ende der sechziger Jahre gelang Morgan und Wells dann die Ausbildung von Triplex-Strukturen aus heteropolymeren DNA-Strängen, in denen sich immerhin zwei verschiedene Nucleotide wiederholten: Ein Oligomer mit reiner Thymin-Cytosin-Sequenz vereinigte sich mit einer Doppelhelix, deren Sprossen aus G:C und A:T bestanden. Das Resultat war eine Triplex-Struktur aus T:A:T- und aus C+:G:C-Einheiten. Dies war das erste starke Indiz dafür, daß Triplex-Strukturen auch an natürlichen Genen entstehen könnten und nicht nur an künstlichen einfachen DNA-Doppelhelices. Doch fehlte zu jener Zeit noch das methodische und technische Rüstzeug, um diese Idee weiterzuverfolgen. Man konnte damals zum Beispiel weder Gene klonieren noch Oligonucleotide von Automaten herstellen lassen.


Triplex-Bildner für Kontrollregionen

Ende der achtziger Jahre waren die- se Probleme überwunden. Zudem hatte man bereits zu einem guten Teil erforscht, wie die Transkription von Genen reguliert wird. Im Prinzip besteht ein Gen nämlich aus zwei Abschnitten: einer regulatorischen Region, die seine Transkriptionsrate steuert, und der codierenden Region, in der die Amonisäureabfolge des entsprechenden Proteins verschlüsselt ist. Erst wenn sich bestimmte, als Transkriptionsfaktoren bezeichnete Proteine an spezifische Stellen der Kontrollregion geheftet haben, kann sich das Enzym RNA-Polymerase anlagern und beim Entlangwandern an der codierenden Region eine RNA-Kopie erstellen (Bild 4 links oben).

Die codierende Region ist normalerweise mit schützenden Proteinen komplexiert und darum kaum von außen für irgendwelche Substanzen zugänglich. Hingegen liegen Teile der Kontrollregion oft wesentlich offener (was wegen ihrer Funktion auch verständlich ist).

Aufgrund dieser Einsichten schien es angeraten, sich auf die Konstruktion von Oligonucleotiden zu konzentrieren, welche die Kontrollregion eines Zielgens besetzen und Transkriptionsfaktoren gewissermaßen von der Arbeit abhalten würden. Zuerst brauchte man aber mehr Belege, daß synthetische Oligonucleotide tatsächlich Basenpaarsequenzen bei natürlichen Genen erkennen können.

Einen solchen Beweis erbrachten 1987 unabhängig voneinander Peter P. Dervan vom California Institute of Technology in Pasadena und Hélène in Paris: Unter bestimmten Umständen kann ein entsprechend konstruiertes Oligonucleotid mit natürlichen Genen eine Triplex-Struktur von T:A:T- und C+:G:C-Einheiten bilden, und zwar an Stellen, wo der eine DNA-Strang überwiegend die Purinbasen Adenin und Guanin trägt und der andere entsprechend die Pyrimidinbasen Thymin und Cytosin. Wie sich inzwischen gezeigt hat, heften sich die bisher untersuchten Oligonucleotide im typischen Fall einzig und allein an den purinreichen Strang und dort jeweils an die Purin-Basen.

Ein schwieriges Hindernis für die therapeutische Umsetzung der Triplex-Strategie bestand jedoch weiterhin. Wie bereits bei den Experimenten von Morgan und Wells bildeten sich auch bei Dervan und Hélène die Dreifachstränge nur nach Ansäuerung und nicht bei normalen, fast neutralen Bedingungen, wie sie natürlicherweise herrschen.

Dervan konnte das Problem teilweise lösen, indem er zusätzliche Jodatome oder Methylgruppen in die Oligonucleotide einführte. Unsere (Hogans) Gruppe an der Universität Princeton (New Jersey) hatte 1988 mit einem anderen Ansatz Erfolg: Wir setzten an Positionen, an denen nach dem üblichen Konstruktionsprinzip Cytosin hätte stehen müssen, Guanin ein. Diese Base lagert sich von außen gleichfalls an das Guanin in der zu bindenden DNA-Doppelhelix an, wozu sie aber – anders als Cytosin – keine Wasserstoff-Ionen aufnehmen muß. Ein saures Milieu ist deshalb nicht mehr erforderlich.

Die resultierende neue Variante von Triplex-Strukturen – mit Einheiten aus G:G:C statt C+:G:C – wies zudem eine höhere Affinität zu ihrer Ziel-DNA auf. Wie Hogans Gruppe und andere Forscher später herausfanden, sind solche Oligonucleotide manchmal fast ebenso fest an die regulatorischen Bereiche von Genen gebunden wie die Protein-Transkriptionsfaktoren, die sich dort normalerweise anlagern. Dies weckte noch stärkere Hoffnungen auf therapeutisch geeignete Moleküle.

Ihre Konstruktion erfordert freilich genaue Kenntnisse darüber, wie ein gegebenes Oligomer mit seinem Zielbereich innerhalb einer DNA-Doppelhelix interagieren wird. Man weiß inzwischen, daß die bestehenden Wasserstoffbrücken, welche die Doppelhelix zusammenhalten, bei der Triplex-Bildung unbeeinflußt bleiben. Jede Base des Oligonucleotids stellt vielmehr zwei neue Wasserstoffbrücken zu einer Purinbase der Doppelhelix her. Zudem ist die Orientierung unterschiedlich: Oligomere mit Cytosin- und Thymin-Nucleotiden lagern sich bevorzugt gleichsinnig an den purinreichen Strang der Ziel-Doppelhelix an, solche aus Guanin- und Thymin-Nucleotiden gegensinnig. Sie werden ihre Zielsequenz nur erkennen können, wenn man beim Entwurf diese unterschiedlichen Orientierungen berücksichtigt.

Den ersten Beleg, daß sich mit einem Triplex-Oligomer gegen eine Gen-Kontrollregion tatsächlich der Beginn der Boten-RNA-Synthese verhindern läßt, erbrachten 1988 Edith H. Postel und Michael Cooney in Hogans Arbeitsgruppe für das Gen c-myc, das an der Entstehung mancher Krebsformen beteiligt ist. Untersucht haben sie dies in einem zellfreien System: Gen und Oligomer wurden dazu im Reagenzglas mit anderen Komponenten der zellulären Transkriptionsmaschinerie gemischt.

Wenig später gelang es Dervan, ebenfalls im zellfreien System, über Triplex-Bildung die Transkription bestimmter viraler Gene zu unterbinden. Ähnlich vielversprechende Ergebnisse liegen für weitere Gene vor. Das Verfahren funktioniert also prinzipiell, jedenfalls im Reagenzglas.

Neueren Untersuchungen nach können auch Triplex-Oligomere, die sich gegen eine Region mitten im codierenden Bereich statt gegen die Kontrollregion richten, wirksam sein: Die RNA-Polymerase, die in diesem Fall mit der Transkription begonnen hat, läuft dann quasi auf ein Hindernis auf (Bild 4 links unten). Wenn man also kein wirksames Triplex-Oligomer gegen die Kontrollregion zu erzeugen vermag, das die Transkription von vornherein verhindert, könnte vielleicht ein anderes gegen einen Bereich innerhalb der codierenden Region wenigstens ihren Abbruch herbeiführen.


Hürden auf dem Weg zur Anwendungsreife

Untersuchungen an Zellkulturen bestärken die Erwartung, daß auch Triplex-Bildner das pharmazeutische Arsenal einmal verstärken dürften. So konnte Hélène mit Oligonucleotiden gegen die Kontrollregion des Gens für den Zellrezeptor des Immun-Hormons Interleukin-2 dessen Ausprägung unterbinden. Gleiches gelang in Hogans Labor beim c-myc-Gen in einer Zell-Linie aus einem menschlichen Tumor. Entsprechende Ergebnisse über diverse virale und an der Krebsentstehung beteiligte Gene liegen von weiteren Arbeitsgruppen vor. Über einschlägige Versuche an Tieren wurde bislang noch nicht berichtet, und erst recht stehen klinische Versuche am Menschen aus. Das wird sich aber wahrscheinlich innerhalb der nächsten Jahre ändern.

Indes wird die weitere Forschung und Umsetzung bis zur Anwendungsreife nicht immer leicht sein. Zu generellen Schwierigkeiten bei der Entwicklung von Medikamenten auf Basis von Oligonucleotiden kommen spezielle. Zum Beispiel können die heutigen Triplex-Bildner nur dann die Transkription in lebenden Zellen hemmen, wenn man sie in hoher Konzentration der Kultur zuführt. An Möglichkeiten, die Dosierung zu verringern, wird gearbeitet.

Noch schwerer wiegt, daß der angepeilte Abschnitt der Doppelhelix praktisch alle Purine auf einem der beiden Stränge tragen muß. Nur an wenige Abweichungen von diesem Ideal lassen sich die gegenwärtigen Triplex-Bildner angleichen. Doch mehr als die Hälfte aller möglichen Zielsequenzen enthält eine gemischte Folge von Purin- und Pyrimidinbasen pro Strang. In einem ersten Schritt haben Dervan und seine Mitarbeiter die Phosphatgruppen von Oligomeren durch eine chemische Gruppierung ersetzt, die es dem dritten Strangstück ermöglicht, sich wechselweise dem einen oder anderen Einzelstrang der Doppelhelix anzulagern. Weitere, noch komplexere Strukturabwandlungen werden untersucht. Zweifellos wird sich mit einigen die Bandbreite geeigneter Angriffsziele in der DNA für Triplex-Bildner erhöhen lassen.

Noch sind das Antisense- und das Triplex-Verfahren alles andere als perfekt. Wenn sich aber weiterhin Fortschritte wie in letzter Zeit erzielen lassen, sind rasche Verbesserungen zu erwarten. Pharmaka auf dieser genetischen Basis werden, da sind wir zuversichtlich, einmal zum Medikamentenarsenal gegen Krankheiten gehören, insbesondere gegen viele virale und genetisch bedingte, für die es bisher keine Therapien gibt.

Literaturhinweise

- Oligodeoxynucleotides: Antisense Inhibitors of Gene Expression. Von Jack S. Cohen. Macmillan, 1989.

– The Anti-Gene Strategy: Control of Gene Expression by Triplex-Forming Oligonucleotides. Von Claude Hélène in: Anticancer Drug Design, Band 6, Heft 6, Seiten 569 bis 584, Dezember 1991.

– Oligonucleotide-Directed DNA Triple-Helix Formation: An Approach to Artificial Repressors? Von L. James Maher III, Barbara Wold und Peter B. Dervan in: Antisense Research and Development, Band 1, Heft 3, Seiten 227 bis 281, Herbst 1991.

– Antisense Research and Applications. Herausgegeben von Stanley T. Crooke und Bernard Lebleu. CRC Press, 1993.


Aus: Spektrum der Wissenschaft 2 / 1995, Seite 28
© Spektrum der Wissenschaft Verlagsgesellschaft mbH

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