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Die Rolle der Histone bei der Genregulation

Außer der Erbsubstanz enthält der Zellkern auch Eiweißstoffe, die lange als bloßes Verpackungsmaterial für die DNA verkannt wurden. In Wirklichkeit können diese Histone das Ablesen vieler Gene verhindern oder erleichtern.

Noch vor fünf Jahren sprachen die meisten Biowissenschaftler den Histonen jegliche Bedeutung für die Genregulation ab. Zwar bilden diese niedermolekularen Proteine im Zellkern zusammen mit den langen DNA-Strängen, auf denen die Erbinformation liegt, das Chromatin, aus dem die Chromosomen bestehen; doch hatte man sie bei ersten Untersuchungen der Genfunktion im wesentlichen nur als zelleigenes Verpackungsmaterial kennengelernt. Ihr alleiniger Zweck schien zu sein, positiv geladene Spulen zu bilden, um die sich die negativ geladenen DNA-Stränge wickeln müssen, damit sie in den winzigen Zellkern passen.

Inzwischen aber weist eine Untersuchung nach der anderen die fünf Chromosomenproteine als unentbehrliche Helfershelfer der Genregulation aus. Zumindest ein Histon trägt zur Genaktivierung bei: Es begünstigt den Start der Transkription, bei der die Abschnitte der DNA mit der jeweils benötigten Erbinformation in Boten-RNA-Moleküle umgeschrieben werden. (Diese Transkripte dienen dann sozusagen als Blaupausen für den Zusammenbau des betreffenden Proteins.) Manche Histone können die Transkription auch unterdrücken. Inzwischen wird immer deutlicher, daß sich bei Mißachtung dieser Proteine die Steuerungsmechanismen für die Gene nicht vollständig aufklären lassen.

Die Bedeutung der Genregulation

Die Frage, wie Gene an- und abgeschaltet werden, ist schon lange ein Lieblingsthema der Biologen – spielt die Genregulation doch eine zentrale Rolle bei der Embryonalentwicklung vielzelliger Lebewesen. Obwohl in einem heranwachsenden Organismus praktisch alle Zellen über die gleiche Genausstattung verfügen, differenzieren sich manche zu Neuronen, während andere beispielsweise zu Blut- oder Leberzellen werden. Entscheidend dafür ist, welche Gene zu welchem Zeitpunkt an- oder abgeschaltet werden; auf diese Weise entsteht je-ne charakteristische Mischung aus Enzymen und anderen Proteinen, die einer Zelle ihre ganz besonderen Eigenschaften verleiht.

Kennt man die Aktivierung und Repression von Genen genauer, so versteht man wahrscheinlich auch besser, wie und warum diese Prozesse manchmal in krank machender Weise entgleisen. Wenn zum Beispiel Gene, deren Produkte die Zellteilung erleichtern (oder unterdrücken), zu aktiv werden (oder nicht aktiv genug sind), kann Krebs entstehen.

Die Regulationsfunktion der Histone ist wohl nur deshalb so lange verborgen geblieben, weil sich auch an nackter, nicht an Histone gebundener DNA die Transkription in Gang setzen läßt; dazu muß man nur Zellextrakte zufügen, die bestimmte Regulatorproteine enthalten. Daß solche zellfreien Versuche gelangen, verleitete viele Fachleute zu dem Fehlschluß, die Histone seien an der Genregulation im lebenden Organismus nicht beteiligt.

Wenngleich diese Folgerung falsch war, verschafften solche und andere Experimente doch zumindest einen grundlegenden Einblick in die Mechanismen der Genaktivierung. In Verbindung mit Strukturanalysen des Chromatins ebneten sie zugleich den Weg für einen Großteil der Untersuchungen, die letztlich die Bedeutung der Histone aufdeckten.

Eine der ersten entscheidenden Entdeckungen war beispielsweise die Erkenntnis, daß die Gene der eukaryotischen (kernhaltigen) Zellen mindestens drei Abschnitte mit unterschiedlicher Funktion umfassen (Bild 2). Einer ist selbstverständlich die codierende Region, in der die Aminosäuresequenz des zugehörigen Proteins festgelegt ist; die anderen sind abgegrenzte Bereiche, die mit darüber entscheiden, ob der codierende Abschnitt in Boten-RNA umkopiert wird und wie viele dieser RNA-Moleküle entstehen.

Damit ein Gen angeschaltet wird, muß sich eine Gruppe von Eiweißstoffen an einer Steuerregion der DNA zusammenlagern, die man gewöhnlich als proximalen Promotor bezeichnet. Zunächst bindet sich ein Protein an einen Teil des Promotors, die TATA-Box; und an dieses heften sich dann weite- re Proteine unter Bildung des sogenannten Präinitiations-Komplexes. Die TA-TA-Box heißt so, weil sie die Nucleotidsequenz TATAAATA oder eine leichte Abwandlung davon enthält. (Die Nucleotide, die Bausteine der DNA, unterscheiden sich in den Basen, die sie tragen: Thymin, Adenin, Guanin und Cytosin, abgekürzt T, A, G und C].)

Nachdem sich der Präinitiations-Komplex gebildet hat, rückt einer seiner Bestandteile, das Enzym RNA-Polymerase, an eine besondere Position innerhalb des proximalen Promotors. Von dieser sogenannten Transkriptions-Initiationsstelle wandert es dann (ähnlich wie ein Zug auf einem Gleis) an der DNA entlang zur codierenden Region und weiter bis zu deren Ende; dabei synthetisiert es die Boten-RNA. Da die Proteine des Präinitiations-Komplexes für sich allein bereits, wenn sie sich im Reagenzglas unter den richtigen Bedingungen an die DNA anlagern, für ein niedriges Grundniveau der Transkription sorgen, bezeichnet man sie manchmal auch als Basisfaktoren.

Damit die Produktion der Boten-RNA ihren maximalen Umfang erreicht, müssen sich allerdings an einer zweiten Regulationsstelle, der stromaufwärts (in Ableserichtung vor den anderen Abschnitten) gelegenen Aktivierungssequenz, weitere Proteine – die Aktivatoren – festheften. (Bei vielen eukaryotischen Organismen nennt man derartige Aktivierungssequenzen nach dem englischen Wort für Verstärker auch Enhancer.)

Der Aufbau des Nucleosoms

Schon früher hatte man durch Analysen von Struktur und Chemie des Chromatins herausgefunden, daß es fünf grundlegende Arten von Histonen gibt: die Typen H1, H2A, H2B, H3 und H4. Später ergaben Röntgenstrukturanalysen und andere Verfahren, daß die Spulen, um die das DNA-Molekül gewickelt ist, Oktamere (Aggregate aus acht Molekülen) sind, in denen die Histone H4, H3, H2A und H2B jeweils doppelt vorkommen (Bild 1 und Kasten auf Seite 92). Um jedes dieser Oktamere oder Rumpfteilchen (core particles) ist ein DNA-Abschnitt aus etwa 146 Nucleotiden knapp zweimal herumgewunden; das resultierende Gebilde bezeichnet man als Nucleosom (siehe „Das Nucleosom“ von Roger D. Kornberg und Aaron Klug, Spektrum der Wissenschaft, April 1981, Seite 28).

Bei den meisten eukaryotischen Organismen wird die DNA im Nucleosom außerdem durch ein einzelnes Molekül des Histons H1 an ihrem Platz gehalten. Dieses Protein bindet sich außen sowohl an die um das Oktamer gewickelte DNA als auch an das freie DNA-Stück, das sich als Linker (nach dem englischen Wort für Bindeglied) von einem Nucleosom zum nächsten erstreckt. Das Histon H1 ist aber für die Bildung der Nucleosomen nicht unbedingt erforderlich. So produziert die Bäcker- oder Bierhefe (Saccharomyces cerevisiae) – ein einzelliger Organismus, an dem viele Erkenntnisse über die Genregulation gewonnen wurden – offenbar nur sehr wenig oder gar kein H1, und dennoch enthalten ihre Chromosomen reichlich Nucleosomen.

Andererseits scheint H1 wesentlich zu der dichten, platzsparenden Packung der DNA in den Kernen vielzelliger Lebewesen beizutragen. Dort ist das Chromatin überwiegend spiralig zu Fasern mit einem Durchmesser von 30 Nanometern (millionstel Millimetern) aufgewunden, wobei jede Windung ungefähr sechs Nucleosomen enthält (siehe Kasten auf dieser Seite). Dagegen scheint das Chromatin bei der Hefe größtenteils in gestreckter Form vorzuliegen – als eine Art Perlenkette, deren Dicke von zehn Nanometer dem Durchmesser eines einzelnen Nucleosoms entspricht.

Vor dem Hintergrund dieser Erkenntnisse über die Struktur des Chromatins fragten sich Anfang der achtziger Jahre einige Wissenschaftler, ob TATA-Boxen, stromaufwärts gelegene Aktivierungssequenzen und die sich jeweils daran bindenden Proteine wirklich allein für die Genregulation verantwortlich seien. Läge es nicht nahe, daß auch die Histone eine Rolle spielten? Schon in den sechziger Jahre hatten einige Untersuchungen darauf hingedeutet, daß Histone möglicherweise die Transkription unterdrücken, aber die Befunde waren nicht besonders stichhaltig.

Knapp 20 Jahre später erlaubten die methodischen Fortschritte genauere Untersuchungen. Inzwischen hatte auch eine Entdeckung aus dem Bereich der Evolutionsbiologie aufhorchen lassen: Bei der Analyse der Aminosäuresequenzen von Histonen war herausgekommen, daß sie sich von einer Spezies zur anderen kaum unterscheiden – die Histone der Erbse etwa gleichen weitgehend denen des Rinds. Eine solche Übereinstimmung im Aufbau eines Molekültyps bei verschiedenen Arten ist aber im allgemeinen ein Hinweis, daß genau diese Aminosäuresequenz für das Funktionieren der Zellen von großer Bedeutung ist. Bestünde die Aufgabe der Histone nur darin, die negativ geladene DNA aufzuwickeln, käme nahezu jedes Protein mit vielen positiv geladenen Aminosäuren in Frage, und die Na-tur hätte nicht eine bestimmte Sequenz über Jahrmillionen hinweg strikt beibehalten müssen.

Erste Hinweise aus Reagenzglas-Versuchen

Tatsächlich lieferte eine Reihe von Experimenten in zellfreien Systemen eindrucksvolle Belege für eine Beteiligung der Histone an der Genregulation (siehe Kasten auf Seite 97). Joseph A. Knezetic und Donal S. Luse von der Medizinischen Fakultät der Universität Cincinnati (Ohio) brachten im Jahre 1986 Histonproteine mit DNA-Molekülen zusammen, die Gene eines menschlichen Adenovirus enthielten. Wenn die Wissenschaftler anschließend Fraktionen aus menschlichen Zellen mit den Basisfaktoren (darunter RNA-Polymerase) hinzufügten, hinderten die gebildeten Nucleosomen diese Faktoren daran, die Transkription in Gang zu setzen.

Etwas später zeigte die Arbeitsgrup-pe von Roger D. Kornberg an der Stan-ford-Universität (Kalifornien), daß der Transkriptionsstart bereits unterbunden wird, wenn man gezielt nur die TATA-Boxen in Nucleosomen einschließt. Andererseits wird, wie Kornbergs Team und unabhängig davon auch Donald D. Brown und seine Mitarbeiter an der Carnegie-Institution in der US-Bundeshauptstadt Washington feststellten, die Transkription nicht blockiert, wenn dafür gesorgt ist, daß sich nur in der codierenden Region Nucleosomen ausbilden. (In späteren Untersuchungen erwies sich allerdings, daß Nucleosomen die vorbeilaufende RNA-Polymerase abbremsen können.)

Dementsprechend sollten Histone imstande sein, auch in normalen, vollständigen Zellen die Transkription von Genen zu unterdrücken, indem sie die An-lagerung der Basisfaktoren an die DNA verhindern. Damit das Gen aktiv werden kann, müssen sich die Nucleosomen-Rumpfteilchen offenbar von der TATA-Box lösen.

Andere Experimente an zellfreien Systemen ließen vermuten, daß Aktivatorproteine, die sich an die Enhancer binden, die Nucleosomen destabilisieren. Wie Beverly M. Emerson und Gary Felsenfeld von den National Institutes of Health (NIH) in Bethesda (Maryland) schon 1984 gezeigt hatten, können Proteine, die sich an Regulationssequenzen der DNA heften, die Bildung von Nucleosomen an diesen Stellen verhindern. Ergänzend dazu fanden Luse, Robert G. Roeder von der Rockefeller-Universität in New York und andere später unabhängig voneinander heraus, daß Histone und Basisfaktoren um den Zugang zur TATA-Box konkurrieren.

Die genannten Forscher setzten der DNA in unterschiedlicher Reihenfolge Histone und Basisfaktoren zu. Die Transkription kam nur dann in Gang, wenn die Basisfaktoren sich an die TATA-Elemente heften konnten, bevor die Histone hinzukamen. Wurden dagegen alle Proteine gleichzeitig zugegeben, setzten sich die Histone durch.

Bei ähnlichen In-vitro-Experimenten machten Jerry L. Workman, Roeder und ihre Kollegen an der Rockefeller-Universität eine merkwürdige Entdeckung. Nach ihren Befunden gewinnen, wenn man der DNA gleichzeitig sowohl Histone als auch Zellextrakte mit Basisfaktoren und Aktivatorproteinen zusetzt, die Basisfaktoren die Oberhand. Ungeachtet der Histone heften sie sich an die TATA-Boxen, so daß diese nicht in Nu-cleosomen aufgenommen werden. Dazu passen Untersuchungen von James T. Kadonaga und seinen Mitarbeitern an der Universität von Kalifornien in San Diego, wonach die Aktivatoren in zellfreien Systemen verhindern, daß das Hi-ston H1 die Transkription blockiert.

Dies führte auf eine interessante Vermutung: Vielleicht sorgen die Aktivatorproteine direkt oder indirekt dafür, daß sich die Bindungen zwischen Histonen und DNA im Zellkern lockern. Beispielsweise könnte ein Aktivator einen Basisfaktor im Präinitiations-Komplex so modifizieren, daß dieser die Nucleosomen aufzulösen und sich Zugang zum TATA-Element zu verschaffen vermag.

Experimente an lebenden Zellen

Untersuchungen mit Zellextrakten sind äußerst nützlich, aber ihre Ergebnisse spiegeln nicht unbedingt die tatsächlichen Abläufe in den Zellen eines vollständigen Organismus wider. Parallel zu den Arbeiten mit zellfreien Extrakten – und manchmal dadurch angeregt – beschäftigten sich deshalb mehrere Labors, darunter meines an der Universität von Kalifornien in Los Angeles, auch mit der Rolle der Histone in lebenden Zellen. Wir stellten uns Fragen wie: Werden TATA-Boxen normalerweise in Nucleosomen verpackt? Verhindern die Histon-Rumpfteilchen an derart gebundenen TATA-Elementen die Transkription? Wie lassen sich die Bindungen zwischen den Histon-Oktameren und der DNA in bestehenden Nucleosomen schwächen?

Einige besonders überzeugende Belege dafür, daß sich an TATA-Boxen häufig Nucleosomen bilden, erbrachten Dennis E. Lohr von der Arizona State University in Tempe sowie Wolfram Horz von der Universität München und ihre Mitarbeiter. Danach stecken bei der Bierhefe viele Gene – etwa die für die Enzyme Galaktokinase (GAL1) und saure Phos-phatase (PHO5) – mit ihren TATA-Bo-xen stets in Nucleosomen.

Wie diese Untersuchungen ferner ergaben, wird bei der Aktivierung solcher Gene zugleich die DNA an den Nucleosomen im Bereich der TATA-Boxen entzwirnt; denn zugesetzte Nucleasen – En-zyme, die DNA spalten – können bei ak-tiven Genen die Abschnitte mit den TA-TA-Boxen leichter schneiden. Das aber setzt voraus, daß sich das DNA-Molekül weit genug aufgefaltet hat, um für die Nucleasen zugänglich zu sein.

Dennoch war damit die grundlegende Frage nach Ursache und Wirkung noch nicht beantwortet. Sind Strukturveränderungen in den Nucleosomen Voraussetzung oder lediglich Folge der Transkription?

Auf der Suche nach einer Antwort veränderten meine Mitarbeiter und ich Ende der achtziger Jahre die Histongene lebender Hefezellen. Wie viele Biologen bevorzugten wir diesen einfachen, einzelligen Organismus. Zum einen hatten Forscher in der Brauerei-Industrie und anderswo seine genetische Ausstattung schon zum großen Teil entschlüsselt; zum anderen waren Methoden entwickelt worden, die genetischen Elemente der Hefe zu experimentellen Zwecken nach Belieben aus dem Erbmaterial her-auszutrennen, neu zu kombinieren und wieder einzusetzen.

Wenn wir die Histonsynthese abschalten konnten – so unsere Überlegung –, würden die TATA-Boxen vieler normalerweise inaktiver Gene nicht mehr in Nucleosomen eingeschlossen. Unter diesen Umständen sollte sich, falls die Entfernung der Histone nicht nur im Reagenzglas, sondern auch in der lebenden Zelle die Transkription ermöglicht, die diesen Genen entsprechende Boten-RNA nachweisen lassen. Dies wäre ein deutliches Zeichen, daß die Kernproteine auch in der intakten Zelle Gene abschalten können.

Zum Unterbinden der Histonsynthese bedienten sich meine Doktoranden Min Han und Ung-Jin Kim einer Methode, die Mark Johnston von der Medizinischen Fakultät der Columbia-Universität in St. Louis (Missouri) entwickelt hatte. Sie ersetzten die normalen Histongene durch solche, bei denen sie die Steuerelemente gegen jene des Gens für Galaktokinase ausgetauscht hatten. In einem glucose-reichen Nährmedium verhindert die Galaktokinase-Regulationssequenz, daß die mit ihr verknüpften Gene transkribiert werden. Um bei den genmanipulierten Zellen die Histonsynthese abzuschalten, mußten Han und Kim sie also nur in ein glucose-haltiges Medium bringen.

Zu Beginn dieses Experiments befanden sich die Zellen in verschiedenen Stadien ihres Vermehrungszyklus. Anders als viele Zellen von ausgewachsenen Tieren (zum Beispiel Nervenzellen) wachsen und teilen sich Hefezellen – durch Knospenbildung – so lange immer weiter, wie die Umgebungsbedingungen das Überleben der Tochterzellen gewährleisten. Bei der Mitose werden die Chromosomen verdoppelt und auf die sich trennenden Zellhälften verteilt. Der eine Chromosomensatz gelangt dabei in die werdende Knospe, die sich anschließend abschnürt und zu einer eigenständigen Zelle wird.

Nachdem die Histonsynthese blockiert war, konnten die genetisch veränderten Hefezellen ihr Erbgut noch einmal ohne Schwierigkeiten verdoppeln. Aber die entstehende DNA enthielt nur noch etwa halb so viele Nucleosomen wie normal. Außerdem zeigte sich bei Zusatz von DNA spaltenden Nucleasen, daß die verbliebenen Nucleosomen größtenteils nicht ihre übliche Position einnahmen, sondern mehr oder weniger zufällig verteilt waren. Deswegen lagen auch TATA-Boxen, die normalerweise in Nucleosomen eingeschlossen sind, nun in freier Form vor. Damit ähnelten die Chromosomen nackter DNA, wie wir sie für unsere experimentellen Zwecke brauchten.

Als nächstes ermittelten Han und Kim, in welchen Mengen die Boten-RNA vieler verschiedener Gene in den nucleosomen-armen Hefezellen gebildet wird. Wie sich dabei zeigte, war die Aktivität der sogenannten konstitutiven Gene, deren Produkte die Zelle zur Aufrechterhaltung ihrer Lebensfunktionen andauernd benötigt, nicht erhöht. Falls Nucleosomen die Transkription unterdrücken, ist dies auch nicht weiter verwunderlich. Da Gene, die laufend gebraucht werden, wohl schon vor Beginn des Experiments an ihren TATA-Boxen keine vollständigen Nucleosomen besitzen, wirken sich Methoden, mit denen man die Histone von der DNA entfernt, bei ihnen nicht aus.

Einen noch stärkeren Beleg für die Repressionshypothese lieferte die genauere Untersuchung der induzierbaren Gene, die ohne äußeren Reiz (etwa die Änderung der Konzentration eines Zuckers oder einer Aminosäure im Nährmedium) normalerweise stumm bleiben. Wie Han und Linda K. Durrin mit diversen genetischen Manipulationen feststellten, läßt sich bei vielen derartigen Genen durch Entfernen der Nucleosomen von der TATA-Box die Synthese von Boten-RNA in Gang setzen. Die Transkription findet sogar ohne stromaufwärts gelegene Aktivierungssequenzen statt – ein Hinweis, daß man lediglich die Histone von der TATA-Box entfernen muß, damit sich die Basisfaktoren daran anlagern und die Transkription ihr Grundniveau erreicht. Bei manchen Genen lief die Transkription allerdings nur dann mit maximaler Geschwindigkeit ab, wenn die Verstärkersequenzen wieder eingefügt wurden.

Auf der Grundlage dieser Befunde und der Ergebnisse von In-vitro-Untersuchungen haben meine Kollegen und ich ein neues Modell entwickelt (Bild 4). Danach ist das Anschalten von Genen ein zweistufiger Vorgang. Am Anfang, im histon-abhängigen Aktivierungsstadium, sorgen Aktivatorproteine an der stromaufwärts gelegenen Aktivierungssequenz direkt oder indirekt dafür, daß das Histon-Rumpfteilchen sich von der TATA-Box löst, so daß sich die Basisfaktoren an sie anlagern und den Präinitiations-Komplex bilden können, was eine Transkription auf dem Grundniveau ermöglicht. Im zweiten, von den Histonen unabhängigen Stadium bringen die Aktivatoren durch Stimulation des Präinitiations-Komplexes die Transkription auf Maximalgeschwindigkeit.

Im Jahre 1988 fanden Fred Winston und seine Mitarbeiter von der Medizinischen Fakultät der Harvard-Universität in Cambridge (Massachusetts) an lebenden Zellen weitere Indizien dafür, daß Histone an der Genregulation beteiligt sind. Grundlage ihrer Untersuchungen war die Entdeckung von Gerald R. Fink und seinen Mitarbeitern am Whitehead-Institut in Cambridge (Massachusetts), daß sich in manchen mutierten Hefezellen ein bewegliches (transponierbares) genetisches Element namens Ty in der Nähe der TATA-Box des Gens HIS4 einbaut. (HIS4 codiert kein Histon, sondern ein Enzym, das an der Verwertung der Aminosäure Histidin beteiligt ist.) Durch diesen Einbau beginnt die Transkription im Ty-Element und nicht am Anfang des Gens HIS4; als Folge davon entsteht ein sinnloses Transkript, das nicht als Vorlage für die Synthese des Proteins HIS4 dienen kann.

Wie Winstons Arbeitsgruppe nun herausfand, wird die Wirkung von Ty aufgehoben, wenn man mehr Kopien der Gene für die Histone H2A und H2B ins Hefegenom einführt; dann entstehen normale Transkripte von HIS4. Dies ließ erahnen, daß die Histone für die Genregulation wichtiger sein könnten als bis dahin angenommen.

Die Rolle der Histon-Schwänze

Wenn die Aufhebung der histon-abhängigen Repression bei Eukaryoten der unentbehrliche erste Schritt zum Anschalten eines stummen Gens ist, erhebt sich als nächstes die Frage, wie die Bindungen zwischen den Histonen und der TATA-Box gelockert werden. Meine Kollegen und ich glauben, daß dafür spezifische Bindungen zwischen Aktivatorproteinen oder Zwischenstufen und dem „Schwanzabschnitt“ des Histons H4 verantwortlich sind. Jedes Histon in der Spule aus acht Molekülen ist in zwei Domänen unterteilt. Die Kopfdomäne enthält das Carboxyl-Ende (–COOH) des Proteins und ist zu zwei hydrophoben (wasserabstoßenden) Spiralstrukturen aufgewickelt; durch Verzahnung dieser Spiralen entsteht das Hauptgerüst des Histon-Oktamers. Die Schwanzdomäne mit dem Amino-Ende (–NH2) ist dagegen hydrophil (wasseranziehend) und nicht aufgewunden, sondern ähnelt einem biegsamen Seil.

Auf die Idee, daß die Histon-Schwänze an der Regulation beteiligt sein könnten, brachten uns unter anderem Befunde aus den Labors von Harold Weintraub, der heute am Fred-C.-Hutchinson-Krebszentrum in Seattle arbeitet, und von James P. Whitlock sowie Robert T. Simpson an den NIH, wonach diese Seile kaum etwas mit dem Zusammenbau und der Stabilität der Nucleosomen zu tun haben. Andererseits könnten sie, da sie aus dem Spiralbereich herausragen, leichter als die Kopfdomänen mit Molekülen in der Umgebung des Chromatins in Kontakt treten.

Auch andere aufschlußreiche Berichte lenkten unser Interesse auf die Histon-Schwänze. Wie Vincent G. Allfrey und seine Kollegen an der Rockefeller-Universität schon 1977 beobachtet hatten, werden im Verlauf der Transkription oft Acetylgruppen (CH3CO–) an diese Schwänze angehängt. Dadurch sollte deren positive Ladung neutralisiert werden, was die elektrostatische Anziehung zwischen ihnen und der negativ geladenen DNA aufheben und dazu beitragen könnte, daß sich die Histone von den TATA-Boxen lösen. Allerdings ist bis heute nicht geklärt, ob die Acetylgruppen vor oder nach der Transkription an-gefügt werden.

Einen direkten Hinweis, daß die Schwänze bei der Lösung der TATA-Boxen von den Nucleosomen eine Rolle spielen, fand Linda Durrin 1991. Indem sie aus dem Schwanz des Histons H4 die Aminosäuren Nummer 4 bis 23 entfernte, konnte sie die Transkription mehrerer normalerweise induzierbarer Hefegene – darunter solche, deren Produkte am Stoffwechsel des Zuckers Galaktose beteiligt sind – stark hemmen. Das ließ vermuten, daß der künstlich entfernte Abschnitt oder ein Teil davon normalerweise mit dem Transkriptionsapparat in Wechselwirkung tritt und so das Ablesen des Gens ermöglicht.

Linda Durrins Entdeckung veranlaßte meine Kollegen und mich, unser Modell für die Genregulation um detailliertere Aussagen zum ersten Stadium, also der histon-abhängigen Aktivierung, zu ergänzen. Danach heften sich die Aktivatoren oder andere, von ihnen beeinflußte Proteine zwischen den Aminosäuren 4 und 23 an den Schwanz des Histons H4 und verdrängen so die Histone von der TATA-Box (Bild 4).

Inzwischen haben wir auch eine Vorstellung davon, wie das im einzelnen geschehen könnte. Sie gründet sich unter anderem auf genauere Erkenntnisse darüber, wie sich Nucleosomen bilden und auflösen. Zum Teil stammen diese Einsichten schon von Abraham Worcel, der seinerzeit an der Princeton-Universität (New Jersey) arbeitete. Nach seiner Theorie lagern sich im ersten Schritt der Nucleosombildung je zwei Moleküle der Histone H3 und H4 zu einer Vierergruppe zusammen. Um dieses Tetramer wickelt sich bereits DNA, die dabei mit allen vier Molekülen in Kontakt kommt. (Felsenfeld und Alan P. Wolffe von den NIH sowie Kensal E. Van Holde von der Oregon State University in Corvallis konnten nachweisen, daß das Tetramer stabil ist und sich in vieler Hinsicht wie ein vollständiges Nucleosom verhält.)

Experimentellen Befunden zufolge sorgt die Viererstruktur anschließend da-für, daß sich zwei Paare (Dimere) der Histone H2A und H2B an das Tetramer heften, was weitere DNA dazu bringt, sich um das Rumpfteilchen zu wickeln. Wie Bradford B. Baer und Daniela Rhodes vom Forschungslaboratorium für Molekularbiologie des britischen Medizinischen Forschungsrates in Cambridge feststellten, blockieren Nucleosomen ohne die H2A-H2B-Dimere die Transkription nicht so wirksam wie das vollständige Oktamer. Zudem lassen Untersuchungen von Vaughn Jackson, Roger Chalkley und ihren Mitarbeitern an der Universität von Iowa in Iowa City darauf schließen, daß sich die Histone H2A und H2B leicht von dem restlichen Tetramer lösen und von einem Nucleosom zum anderen überwechseln können.

Demnach wäre es denkbar, daß die Anlagerung der Aktivatorproteine oder ihrer Hilfsfaktoren an eine bestimmte Stelle seines Schwanzes das Histon H4 dazu veranlaßt, seine Konformation (Gestalt) zu ändern. Dies könnte die vorübergehende Abspaltung von H2A und H2B vom Nucleosom zur Folge haben. Dadurch aber würde möglicherweise ein Teil der DNA vom Nucleosom abgespult und für die Basisfaktoren zugänglich. Nach dem Durchgang der RNA-Polymerase könnten sich die H2A-H2B-Dimere erneut an das H3-H4-Tetramer anlagern, so daß das Nucleosom wieder komplett wäre.

Histone mit Hemmfunktion

Als wir den Schwanz des Histons H4 eingehender untersuchten, machten wir die befremdliche Entdeckung, daß seine einzelnen Abschnitte unterschiedliche, sich teils widersprechende Aufgaben haben. So sind zwar einerseits bestimmte Aminosäuren zwischen den Positionen 4 und 23 für die Transkription mehrerer Gene erforderlich, zugleich aber ist ein Teil des Schwanzes an der Repression anderer Gene beteiligt.

Eine wichtige solche Hemmfunktion identifizierte Paul S. Kayne, ein Doktorand in meinem Labor; danach hat der H4-Schwanz mit der Repression der stummen Paarungsloci zu tun (Bild 3). In jeder Zelle der Bierhefe gibt es zwei solche genetischen Regionen. Sie dürfen nie aktiv werden – sonst können sich die betreffenden Zellen nicht mehr paaren (miteinander verschmelzen). Hefezellen vereinigen sich im haploiden Zustand, wenn sie nur über einen einzigen Chromosomensatz verfügen. Die Verschmelzung zweier haploider Zellen ergibt wieder eine diploide Zelle – ganz ähnlich wie bei der Vereinigung von Ei- und Samenzelle ein diploider Embryo mit je einem väterlichen und einen mütterlichen Chromosomensatz entsteht.

Wie Kayne herausfand, geht die Paarungsfähigkeit der Hefe stark zurück, wenn man die Aminosäuren Nummer 15 bis 19 aus dem Schwanz des Histons H4 entfernt; denn dadurch werden in zuvor reprimierten Regionen Gene aktiviert. Wie in unserem Labor sowie in denen von M. Mitchell Smith an der Universität von Virginia in Charlottesville und von Jack Szostak an der Harvard-Universität gezeigt wurde, genügt es sogar, eine einzelne Aminosäure zwischen den Positionen 16 und 19 gegen eine andere auszutauschen. Demnach sind alle Ami-nosäuren, die normalerweise in diesem Bereich liegen, für die Repression der stummen Paarungsloci erforderlich.

Lianna M. Johnson aus unserem Labor bewies kürzlich, daß auch die meisten Aminosäuren an den Positionen 21 bis 29 für die Repression dieser Gene vonnöten sind. Wie sie weiter herausfand, kann der Austausch einer von zwei Aminosäuren in einem Protein namens Sir 3 die betreffenden Loci wieder verstummen lassen und den durch die H4-Mutation hervorgerufenen Paarungsdefekt ausgleichen. Das spricht dafür, daß die Proteine H4 und Sir 3 bei der Re-pression der stummen Paarungsloci zusammenwirken (Bild 3).

Diese liegen auf dem Hefechromosom Nummer III in der Nähe der Telomere (Chromosomen-Enden). Daniel E. Gottschling und seine Mitarbeiter an der Universität Chicago haben die Schwänze des Histons H4 auch mit der Repression anderer Gene in der Nähe der Telomere in Verbindung gebracht. Der überraschende Befund: Dieselben Mutationen in H4, welche die stummen Paa-rungsloci aktivieren, können teilweise auch die Repression von Genen aufheben, die künstlich in der Nähe der Te-lomere eingebaut wurden. Analoges gilt für Mutationen in manchen Sir-Proteinen. Demnach scheinen also Gene, die in der Nähe der Telomere liegen, im wesentlichen auf die gleiche Weise abgeschaltet zu werden wie die stummen Paarungsloci.

Die Analyse der Paarung von Hefezellen hat nicht nur konkrete neue Details über die Funktionsweise der Histone enthüllt, sondern auch ein Hilfsmittel für deren weitere Untersuchung geliefert. Genetische Defekte einer besonderen Art, die man zusammenfassend als swi-Mutationen (nach englisch switch, Schalter) bezeichnet, blockieren bei der Hefe die Aktivierung des Gens für ein Enzym, das für die Ausprägung des Paarungstyps unentbehrlich ist (bei der Hefe gibt es zwei Paarungstypen: a und alpha). Wie Ira Herskowitz von der Universität von Kalifornien in San Francisco und seine Mitarbeiter feststellten, wirken bestimmte andere Mutationen (sin-Mutationen genannt) dieser Blockade entgegen. Dazu zählt eine in dem Gen für das Histon H3, was dafür spricht, daß der betreffende Abschnitt von H3 die Genaktivität beeinflussen kann. Von der Entdeckung neuer sin-Mutationen darf man sich also weitere Hinweise auf Histonabschnitte erhoffen, die an der Genregulation beteiligt sind. Solche Mutationen sollten zudem helfen, Proteine aufzuspüren, die über Einflüsse auf die Histone Gene steuern.

Wichtig in diesem Zusammenhang ist auch eine Entdeckung aus Winstons La-bor: Manche sogenannten snf-Mutationen, die Marian Carlson von der Columbia-Universität in New York erzeugt hat, ähneln in ihrer Wirkung den swi-Mutationen. Mit Hilfe der Proteine, die aus der Normalform der mutierten Gene her-vorgehen, dürften die Nucleosomen so weit aufgeschnürt werden, daß die Tran-skription stattfinden kann. Die Erforschung von Mutationen wie swi, snf und anderen, die sich auf die Chromatinstruktur auswirken, entwickelt sich zu einem immer wichtigeren Aspekt bei der Aufklärung der Genregulation.

Da H3 in vieler Hinsicht (etwa in seinem Acetylierungsmuster und seiner Funktion bei der Bildung und Stabilisierung der Nucleosomen) dem Histon H4 ähnelt, sollte man vernünftigerweise erwarten, daß sein Schwanz in gleicher Weise Gene steuert wie der von H4 – also beispielsweise ebenfalls die stummen Paarungsloci reprimiert. Das ist je-doch nicht der Fall. Außerdem hat Randall K. Mann aus meinem Labor festgestellt, daß der Schwanz von H3 in vielen Fällen für die Repression solcher Gene erforderlich ist, die den Schwanz von H4 für ihre Aktivierung benötigen.

Um zu erklären, warum H3 und H4 so unterschiedliche Funktionen erfüllen, muß man mehr darüber in Erfahrung bringen, wie sie mit anderen Proteinen und mit der DNA in Wechselwirkung treten. Noch kaum bekannt ist auch, welche Funktionen H2A und H2B innerhalb der Zelle haben; fest steht nur, daß es andere sind als bei H3 und H4.

Unser Wissen darüber, wie Histone Gene regulieren, stammt großenteils aus Untersuchungen an der Hefe. Bei diesem Organismus scheinen die stromaufwärts gelegenen Aktivierungssequenzen dauerhaft nucleosomenfrei zu sein. In menschlichen Zellen dagegen liegt das Chromatin gewöhnlich überwiegend in Form der 30-Nanometer-Faser vor. Daher müssen menschliche Zellen während der Embryonalentwicklung vermutlich einige Gene aktivieren, deren Enhancer in Nucleosomen verpackt sind. Wie könnten sie das bewerkstelligen?

Eine plausible Antwort gründet sich auf Entdeckungen von Helen M. Blau von der Stanford-Universität, wonach bestimmte Proteine (die vielleicht nicht mit den Aktivatoren identisch sind) in menschlichen Zellen die Nucleosomen von den Enhancern zu verdrängen vermögen. Möglich wäre aber auch, daß die Enhancer von Genen, welche die Zelle von einem Augenblick auf den anderen an- oder abschalten muß (wie die meisten Gene der Hefe), andauernd in Be-reitschaft – und das heißt, frei von Nu-cleosomen – gehalten werden.

Noch bleibt viel zu tun, bis man alle Aufgaben der Histone bei der Hefe und bei anderen Organismen kennt. Aber schon die bisherigen Entdeckungen haben die alte Lehrmeinung widerlegt, wonach Histon-Rumpfteilchen nichts weiter als reaktionsunfähige molekulare Spulen sind. Nach den Ergebnissen unserer und anderer Untersuchungen können Histone oder einzelne Domänen daraus Gene gleichermaßen reprimieren wie aktivieren. Vielleicht üben bestimmte Regulationsproteine im Zusammenwirken mit Aktivatoren ihre Steuerfunktion aus, indem sie sich in spezifischer Weise gleichzeitig an die DNA und an kritische Domänen der Histone heften.

Als nächstes gilt es nun, einerseits mehr darüber in Erfahrung zu bringen, welche Aufgaben die Natur den kleinen Abschnitten in den Histondomänen zugedacht hat, und andererseits die Regulationsproteine zu ermitteln, die mit die-sen Abschnitten in Wechselwirkung treten. An solchen Bemühungen beteiligen sich heute zahlreiche Wissenschaftler, die sich früher von den Histonen nicht viel versprachen. Die Erforschung der Chromatinstruktur ist plötzlich zu einem aufregenden neuen Gebiet an der vordersten Front der Genetik geworden.


Aus: Spektrum der Wissenschaft 1 / 1993, Seite 90
© Spektrum der Wissenschaft Verlagsgesellschaft mbH

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