Spätestens seit die ersten Fälle von Rinderwahnsinn in Deutschland aufgetaucht sind, ist auch die deutsche Bevölkerung beunruhigt bis alarmiert. Die drei Buchstaben BSE, Kürzel für die englische wissenschaftliche Bezeichnung bovine spongiform encephalopathy, zieren die Titelseiten großer Magazine. Sie bezeichnen die schwammartige (spongiform) Degeneration des Zentralnervensystems (encephalopathy), die bei betroffenen Rindern (bovine) im Endstadium auftritt.

Nach heutigem Kenntnisstand kann BSE auf den Menschen übertragen werden und nach einer Inkubationszeit von einem bis mehreren Jahren die neue Variante der Creutzfeldt-Jacob-Krankheit (vCJD) hervorrufen, die mit geistigem Verfall und Tod endet. (Die schon lange bekannte eigentliche Creutzfeldt-Jacob-Krankheit nimmt denselben Verlauf, ist aber nicht ansteckend, sondern entsteht mit einer extrem geringen Wahrscheinlichkeit spontan, also ohne äußere Einwirkung.)

Wie groß ist das Infektionsrisiko? Was kann man noch gefahrlos essen? Wie sicher sind die Tests? Wie lang ist die Inkubationszeit bei Rindern und Menschen? Definitive und genaue Antworten auf diese wichtigen Fragen, die in der Öffentlichkeit gestellt werden, lassen sich bisher nicht geben. Der Grund liegt in den Wissenslücken darüber, wie der Erreger des Rinderwahnsinns sich im Körper vermehrt und letztlich die Krankheitssymptome hervorruft. Für ein Verständnis der BSE-Seuche und ihrer Auswirkungen ist es deshalb unerlässlich, die Geschwindigkeiten der zu Grunde liegenden molekularen Prozesse – ihre Kinetik, wie die Chemiker sagen – exakt aufzuklären. Erst auf dieser Grundlage können wirksame Maßnahmen zur Eindämmung der Seuche gefunden werden.

In einer Veröffentlichung mit dem Titel "Prionics" hatte ich 1996 bereits analysiert, wie verschiedene Hypothesen über die Vermehrung des BSE-Erregers und anderer so genannter Prionen mit dem Erkrankungsverlauf und Erkenntnissen über die Ausbreitung der Seuche vereinbar sind. Neuere Ergebnisse bestätigen die Schlussfolgerungen aus meiner damaligen Arbeit. Aus ihr erwuchs inzwischen ein molekulares Modell, auf dessen Basis insbesondere ein neuer Test auf infektiöse Prionen entwickelt wurde, der die Erreger noch in zehn- bis hundertfach gerin-gerer Konzentration nachweisen kann als heutige Standardmethoden. Damit ließe sich auch der Rinderwahnsinn in einem früheren Erkrankungsstadium bereits diagnostizieren. Doch bräuchte man noch um Größenordnungen empfindlichere Tests, um feststellen zu können, ob ein Stück Rindfleisch wirklich unbedenklich ist – ob es also garantiert weniger gefährliche Prionen enthält, als für eine Infektion nötig wären. Die neuen Einsichten in die Kinetik der Prionen-Vermehrung weisen zumindest den Weg zu solchen Nachweismethoden.

Was ist ein Prion?

Stanley Prusiner von der Universität von Kalifornien in San Francisco gebührt das 1997 mit dem Chemie-Nobelpreis gewürdigte Verdienst, das infektiöse Agens von BSE und verwandten Erkrankungen als Protein erkannt zu haben (siehe seinen Artikel "Prionen", Spektrum der Wissenschaft 12/84, S. 48). Er konnte zeigen, dass ein Eiweißstoff mit genau derselben Aminosäuresequenz in jedem gesunden Organismus vorkommt und dort eine bisher nicht bekannte Funktion erfüllt. Für beide prägte Prusiner den Begriff Prion. Heute spricht man von Prion-Protein (PrP) und charakterisiert die normale, zelluläre Form mit dem Suffix c (für englisch cell = Zelle). Das Suffix sc bezeichnet dagegen die pathologische, infektiöse Variante. Es nimmt Bezug auf die schon lange bei Schafen beobachtete, tödlich verlaufende Seuche "scrapie" (Traberkrankheit), an der Prusiner Anfang der achtziger Jahre seine Untersuchungen vornahm (BSE war damals noch nicht bekannt). PrPc und PrPsc unterscheiden sich nur in ihrer räumlichen Struktur, das heißt in der Art und Weise, wie die Aminosäurekette gefaltet ist.

Ein einzelnes PrPsc ist allerdings noch nicht ansteckend. Die "infektiöse Einheit" – also die Mindestmenge, die eine Infektion auslösen kann – schließt vielmehr an die hunderttausend solche PrPsc-Moleküle ein. Dies ließ sich durch Experimente ermitteln, in denen man Gruppen von Versuchstieren mit verschiedenen Mengen an PrPsc beimpfte und dann beobachtete, wie viele der Tiere einer Gruppe nach welcher Zeit erkrankten.

Einen der überzeugendsten Belege für die Richtigkeit von Prusiners Vorstellungen über die Entstehung von Prionen-Erkrankungen lieferte Charles Weissmann und seine Schule an der Universität Zürich. Er wies (unter anderem) nach, dass in Mäusen, deren PrP-Gen ausgeschaltet wurde, sodass sie das zelluläre PrPc nicht mehr herstellen können, eine Infektion mit PrPsc wirkungslos bleibt.

Den quantitativen Beweis, dass Prionen im Einklang mit Prusiners Hypothese keine Erbsubstanz in Form von Nucleinsäuren enthalten, führte Detlev Riesner von der Universität Düsseldorf. Mit äußerst empfindlichen physikalisch-chemischen Messungen konnte er keinerlei RNA oder DNA im Erreger von Krankheiten wie BSE finden. Auf Grund der Nachweisgrenze von Riesners Verfahren lässt sich ausschließen, dass infektiöse PrPsc-Einheiten mehr als ein Nucleinsäure-Molekül einer Länge von maximal 100 Nucleotiden enthalten; das ist in jedem Fall viel zu wenig, als dass darin das Prion-Protein verschlüsselt sein könnte.

Dies ist eine wichtige Feststellung; denn BSE und andere Prionen-Erkrankungen sind "infektiös" in dem Sinne, dass sich der Verursacher exponentiell vermehrt. Alle solchen Infektionskrankheiten wurden bisher auf "reproduzierbare" Erreger zurückgeführt, deren Basis die Verdopplung der Erbsubstanz RNA oder DNA ist. Bei den Prionen trifft dies offenbar nicht zu. Dennoch setzt ihre Entdeckung die Erkenntnisse der Virologie und Bakteriologie keineswegs außer Kraft. Sie zeigt lediglich, dass es auch nur aus Proteinen bestehende Systeme gibt, die das für Nucleinsäuren typische Replikations-Verhalten "simulieren".

Einen weiteren Fortschritt brachte Kurt Wüthrich an der Eidgenössischen Technischen Hochschule Zürich. Seine Arbeitsgruppe konnte mit Hilfe von Messungen der kernmagnetischen Resonanz (NMR) die Struktur der natürlichen Prionen ermitteln. Demnach enthalten sie einen "globulären" Bereich, in dem die Aminosäurekette drei schraubenartig gewundene (helikale) Strukturen bildet. Dieser Bereich kann ebenso wie der Rest des Moleküls durch ein proteinspaltendes Enzym "verdaut" werden, während dies für einen analogen Abschnitt von PrPsc nicht möglich ist. Das liegt wahrscheinlich daran, dass die pathologische Form weniger Helices und dafür mehr so genannte Beta-Faltblätter enthält, in denen die Aminosäurekette wie der Schussfaden in einem Webstück hin und her läuft und dabei eine wellblechartig geformte Struktur erzeugt. Hier gelingt es den Enzymen nur, einen Teil vom offenen Ende der Kette abzuspalten.

Dieses unterschiedliche Verhalten von PrPc und PrPsc bildet die Grundlage des heute gebräuchlichen Tests zum Nachweis von BSE. Kurt Wüthrich hat ermittelt, wie stark die Prionen verschiedener Tierarten im globulären Strukturbereich voneinander abweichen, und daraus Schlüsse auf eine mögliche Übertragbarkeit der Krankheit zwischen unterschiedlichen Spezies gezogen. So haben zum Beispiel die Prion-Proteine von Rind und Mensch recht ähnliche räumliche Strukturen – was darauf hindeutet, dass die Seuche mit einer gewissen Wahrscheinlichkeit auf die jeweils andere Art übertragen werden kann.

Stanley Prusiner schlug auch als ers-ter einen Mechanismus für die Umwandlung von PrPc in PrPsc vor. Dabei nahm er an, dass sich ein einzelnes PrPscMolekül an ein PrPc anlagert und dieses dadurch veranlasst, gleichfalls die pathologische Form anzunehmen. Das entspräche der direkten Autokatalyse einer Strukturumwandlung: Das infektiöse Agens vermittelt (katalysiert) "eigenhändig" die Konversion der harmlosen in die bösartige Form und sorgt so für seine eigene Vermehrung.

Dagegen postulierte Peter Lansbury vom Brigham and Women’s Hospital in Boston (Massachusetts) einen praktisch eindimensionalen Kettenwachstum-Mechanismus mit vorgelagerter Keimbildung. Demnach ähnelt die Vermehrung des pathologischen PrPsc einer Polymerisation, wie sie bei der Herstellung von linearen Kunststoffen wie Polyethylen stattfindet: Eine Kette aus aneinander gereihten PrPsc-Einheiten wächst, indem sie einzelne PrPc-Moleküle anlagert, bindet und in die pathologische Form umwandelt. Keimbildung für die Kette bedeutet, dass sie erst eine kritische Größe erreicht haben muss, bevor sie schneller neue Einheiten anlagert als sie alte durch Abspaltung verliert. Mit diesem Modell suchte Lansbury vor allem zwei Tatsachen Rechnung zu tragen: dass das PrPsc in den Hirnen der Opfer von Prionen-Erkrankungen gewöhnlich in Form von Stäbchen vorliegt und dass die "infektiöse Einheit" eine große Zahl von PrP-Molekülen umfasst.

Wie reagiert ein Prion?

In meiner Untersuchung von 1996 ging es darum, die beiden Mechanismen auf der Grundlage der chemischen Kinetik gegeneinander abzuwägen. Dabei zeigte sich, dass ein Prusiner-Mechanismus mit nur zwei Prion-Einheiten im katalytischen Schritt nicht plausibel zu machen ist, wenn man realistische Werte für Geschwindigkeits- und Gleichgewichtskonstanten annimmt, wie wir sie für Protein-Protein-Wechselwirkungen kennen. Angewandt auf die spontan auftretende Creutzfeldt-Jacob-Krankheit beim Menschen hieße das: Die Bedingungen sind so kritisch, dass bei einem gegebenen Satz von Parametern die Konzentration von PrPsc entweder kontinuierlich abnimmt oder aber stetig steigt. Es gälte das Prinzip "alles oder nichts": Die Krankheit müsste entweder stets von selbst wieder erlöschen, bevor sie überhaupt richtig ausgebrochen ist, oder aber mit viel höherer Wahrscheinlichkeit spontan entstehen, als sie das tatsächlich tut.

Dieses Problem verschwindet, wenn eine kooperative Wechselwirkung zwischen mehr als zwei Protein-Einheiten auftritt. Etliche "allosterische" Enzyme, die erst durch Anlagerung eines so genannten Effektor-Moleküls in eine wirksame Form umgewandelt werden, steuern ihre Aktivität auf diese Weise. Durch Kooperativität in der autokatalytischen Strukturumwandlung ergibt sich bei geeigneten kinetischen Parametern ein Schwellenwert für den Ausbruch der Krankheit.

Tatsächlich beinhaltet der Lansbury-Mechanismus über die Keimbildung ebenfalls eine Art kooperative Wechselwirkung – in diesem Falle zwischen den Bausteinen der PrPsc-Kette. Ein Baustein allein ist danach nicht fähig, ein PrPc-Molekül festzuhalten und umzuwandeln. Damit die Umwandlung effizient geschieht, müssen mindestens so viele Bausteine zusammenwirken, wie der kritische Keim enthält. Erst dann übertrifft die Geschwindigkeit für den Aufbau der Kette die für ihren Abbau.

Aber da bleibt noch eine Schwierigkeit. Zwar wächst die Kette, nachdem sie die Größe des kritischen Keims erreicht hat, autokatalytisch weiter. Aber es gibt keine exponentielle Beschleunigung, wie sie für autokatalytische Reaktionen typisch ist. Diese setzt voraus, dass nach der Umwandlung sowohl der ursprüngliche Katalysator als auch sein Reaktionsprodukt für weitere autokatalytische Zyklen zur Verfügung stehen, sodass sich die Anzahl der katalytisch wirksamen Spezies mit jedem Reaktionszyklus verdoppelt. Bei fortschreitender Polymerisation trifft das jedoch nicht zu; hier ist gleich bleibend nur jeweils die Proteineinheit am Kettenende katalytisch aktiv.

Doch auch für diese Schwierigkeit gibt es eine Lösung. Der Polymerisationsmechanismus liefert unter einer Bedingung gleichfalls exponentielles Wachstum: wenn die sich verlängernden Ketten immer wieder zerbrechen und damit neue Katalysatoren freisetzen. Martin Nowak – ein "Mitstreiter" aus der Frühzeit der theoretischen Erforschung molekularer Evolutionsprozesse in Göttingen und Wien (Arbeitsgruppe Peter Schuster), der jetzt am Institute for Advanced Study in Princeton tätig ist – hat den Gedanken des Kettenbruchs aufgegriffen und in ein verfeinertes Modell aufgenommen. Mit diesem Modell, das sich in eine mathematisch explizit lösbare Form überführen ließ, konnte Joanna Masel an der Universität Oxford in den letzten Jahren viele Details im Verlauf von Prionen-Erkrankungen erklären, die bislang nicht verständlich waren.

Vermehrungsmodell für den BSE-Erreger

Für sein Modell stellte Nowak zunächst Bilanzgleichungen für das Wachstum, den Bruch und den Abbau von Proteinketten aller möglichen Längen auf. Das Wachstum wird im Wesentlichen durch einen Ausdruck für die Verlängerung der Ketten (Elongation) wiedergegeben. Wie die Elongation und der Kettenbruch zusammenwirken, sodass die Anzahl der katalytisch wirksamen Kettenenden exponentiell zunimmt, ist im Bild auf Seite 43 (in der Onlineversion nicht vorhanden) an einem Modellstrang schematisch gezeigt. Der Abbau, dem alle Polymere unterliegen, sorgt dafür, dass die infektiösen Keime nur eine begrenzte Lebensdauer haben.

Die Elongationsgeschwindigkeit setzt sich aus drei Komponenten zusammen. Sie beschreiben drei teilweise konkurrierende Prozesse:

- die Anlagerung einer Protein-Einheit PrPc an eine der beiden (oder an beide) Endpositionen der PrPsc-Kette; ihre Geschwindigkeit ist durch die Begegnungshäufigkeit der Reaktionspartner auf Grund ihrer Diffusionsbewegung begrenzt;

- die Ablösung der in ihrer Struktur noch nicht umgewandelten PrPc-Einheit;

- die Strukturumwandlung des PrPc in das PrPsc, die für den stabilen Einbau in die Kette sorgt und damit den Elongationsschritt abschließt.

Die Geschwindigkeiten dieser drei Prozesse lassen sich (nach dem Vorbild der Enzymkinetik) in einem einzigen mathematischen Ausdruck zusammenfassen.

Statt nun für jede einzelne PrPsc-Kette gesonderte Bilanzgleichungen aufzustellen, benutzte Nowak zwei Summen-terme, die ich 1996 eingeführt hatte. Der eine beinhaltet die gesamte Menge von PrP-Einheiten, die in den verschieden langen Polymerketten enthalten sind; der andere ist ein Maß für die Anzahl dieser Ketten und damit aller katalytisch wirksamen Endpositionen.

Der Vorteil des Aufsummierens liegt darin, dass sich dabei viele Ausdrücke aus den individuellen Gleichungen kompensieren. So bleiben nur zwei lineare Differenzialgleichungen übrig, welche die Änderung der zwei genannten Summenterme mit der Zeit beschreiben. Sie lassen sich analytisch explizit lösen. Die Lösungen bestehen aus der Summe zweier Exponentialfunktionen, in denen die Zeit einmal mit positivem und einmal mit negativem Vorzeichen als Exponent auftritt.

Die eine Funktion repräsentiert einen Wachstums-, die andere einen Abklingterm. Letzterer beschreibt die Einstellung eines Fließgleichgewichts, in dem eine bestimmte Längenverteilung der Ketten mit definiertem Mittelwert sta-tionär aufrechterhalten wird. Nach einer gewissen Zeit liefert er keinen nennenswerten Beitrag mehr, sodass nur noch der Wachstumsterm wirksam bleibt. Dann steigt sowohl die Anzahl der Polymerketten als auch die der darin enthaltenen PrPsc-Einheiten exponentiell an, bis schließlich der Nachschub an PrPc-Molekülen versiegt.

Die Ursache der langen Inkubationszeit

Joanna Masel hat in ihrer letztes Jahr in Oxford vorgelegten Dissertation dieses Modell im Detail weiterentwickelt sowie alle Folgerungen ausführlich untersucht und mit experimentellen Daten verglichen. Ihre Ergebnisse haben große Bedeutung für die laufenden Bemühungen, Prionen-Erkrankungen noch früher nachzuweisen, als das heute schon möglich ist. Der Vergleich mit gemessenen Daten legt nahe, dass eine Anlagerung von PrPc an eine Kette von PrPsc und seine Umwandlung in ein (bösartiges) PrPsc rund eine Viertelstunde dauert. Die stationäre Kette von PrPsc hat eine mittlere Länge von etwa tausend Einheiten. Sie braucht für ihre Bildung demnach eine tausendmal längere Zeit. Die Experimente ergeben Werte zwischen fünf und zwanzig Tagen. Damit sich ein Fließgleichgewicht mit stationärer Kettenlänge einstellen kann, muss innerhalb dieser Zeitspanne im Mittel ein Kettenbruch erfolgen. Die Halbwertszeit für den Bruch an einer vorgegebenen Stelle beträgt rund dreißig Jahre. Da jede Kette im Mittel etwa tausend mögliche Bruchstellen enthält, findet im Gesamtaggregat etwa alle zehn Tage ein Kettenbruch statt. Kettenaufbau und Bruch halten sich so die Waage; dabei steigt jedoch die Zahl der Ketten (und damit der aktiven Kettenenden) exponentiell an.

Eine wichtige Größe ist auch das Verhältnis von Aufbau- und Eliminationsgeschwindigkeit der PrPsc-Ketten. Nach Messungen an Versuchstieren haben beide etwa die gleiche Größenordnung. Das bedeutet, dass das infektiöse Material sich ständig reproduzieren muss, um als solches zu überleben. Die Ursache der Elimination ist nicht genau bekannt; vielleicht spielt die Immunabwehr eine Rolle, es könnte aber auch andere Prozesse geben, welche die PrPsc-Ketten abbauen oder inaktivieren. Deshalb wurde der Eliminationsgeschwindigkeit nur durch einen unspezifischen Abbauterm Rechnung getragen, der zur Menge des vorhandenen infektiösen Materials proportional ist. Die Abschätzungen von Reaktionszeiten beeinträchtigt das jedoch kaum.

Ein wichtiger Punkt ist noch, dass sich nur das Substrat der Reaktion, das umzuwandelnde PrPc, frei in Lösung bewegen kann und auf diese Weise leicht zu einer wachsenden PrPsc-Kette gelangt (was das Bild "diffusionskontrollierter" schneller Reaktionen rechtfertigt). Die PrPsc-Ketten selbst sind dagegen überwiegend an Membranen gebunden. Das mag auch erklären, warum die "infektiöse Einheit" rund 100000 einzelne Prion-Moleküle umfasst, obwohl die Ketten im Mittel schon bei einer Länge von tausend brechen. Die Bruchstücke bleiben in der Nähe und wirken damit wie kooperative Schwärme. Erst wenn sie sich von der Membran lösen, können sie sich weiträumig ausbreiten.

Das wesentliche Ergebnis der Untersuchungen von Masel besteht darin, dass eine Verdoppelung des vorhandenen Materials bereits Wochen erfordert. Die Vermehrung eines infektiösen Keims bis zueiner Konzentration, in der er analytisch erfassbar ist, braucht Zeiten von der Größenordnung eines Jahres.

Viele Fragen bleiben bei diesen Betrachtungen zwangsläufig ausgeklammert, etwa nach der Anfangs- und Endphase der Infektion, nach den Infektionswegen, nach der Zeit, die bis zum Befall von Hirn und Rückenmark verstreicht, sowie nach der Art der dort in der Endphase angerichteten Zerstörungen. Dies aufzuklären ist jedoch vor allem Sache der Neuropathologen.

Ein empfindlicherer Test zur BSE-Früherkennung

Die Kenntnis der kinetischen Grundlagen der Infektion ist entscheidend für die Frage, wie früh sich die Erkrankung feststellen lässt. Eine möglichst frühe Diagnose wiederum bildet eine wichtige Voraussetzung für die wirkungsvolle Bekämpfung der Seuche.

Wegen der äußerst langsamen Vermehrung der pathologischen Prionen erlaubt ein empfindlicheres Nachweisverfahren zugleich, die Erkrankung um Monate bis Jahre früher zu erkennen. Im Jahre 1994 haben meine Mitarbeiter und ich eine Methode beschrieben, die ideal auf die Identifizierung kleinster Mengen von Prionen zugeschnitten ist. Sie knüpft an eine Idee an, die Rudolf Rigler bereits während eines Gastaufenthalts am Max-Planck-Institut für Biophysikalische Chemie in Göttingen zwischen 1968 und 1971 konzipiert und dann am Karolinska-Institut in Stockholm zur Anwendungsreife weiterentwickelt hat; zwischen 1991 und 1992 war er als Alexander-von-Humboldt-Preisträger noch einmal für ein Jahr in Göttingen.

Es handelt sich um die so genannte FCS-Methode (Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie). Sie stellt das Prinzip der klassischen Fluoreszenzspektroskopie sozusagen auf den Kopf. Bei dieser sind die nachzuweisenden Moleküle mit einem Farbstoff markiert, der bei Beleuchtung bei einer charakteristischen Wellenlänge fluoresziert. Die gesamte Probe wird bestrahlt und die Intensität des Fluoreszenzlichtes gemessen; sie zeigt die Konzentration des gesuchten fluoreszierenden Moleküls an. Diese muss dabei allerdings so groß sein, dass sich das kontinuierlich gemessene Fluoreszenzsignal noch deutlich vom Rauschhintergrund abhebt, den gestreute und reflektierte Lichtquanten verursachen. Das erfordert Konzentrationen oberhalb des nanomolaren Bereiches, also oberhalb von 1015 (einer Billiarde) Teilchen pro Liter.

Bei der neuen Methode genügen dagegen weit niedrigere Konzentrationen. Der Trick besteht darin, nicht mehr das gesamte Probenvolumen zu beleuchten. Stattdessen wird ein Laserstrahl auf ein möglichst kleines (durch die endliche Lichtwellenlänge begrenztes) Raumelement gebündelt. In unserem Falle beträgt das Volumen des Laserfokus weniger als ein Femtoliter (10–15 Liter). Das bringt den Vorteil, dass von einem so kleinen Raumelement nur wenig Streulicht ausgeht und damit der Rauschhintergrund praktisch nicht stört. Scheinbarer Nachteil ist, dass in diesem winzigen Volumen im Allgemeinen auch kein einziges fluoreszierendes Molekül mehr anzutreffen ist. Damit würde sich im Zeitmittel gleichfalls nur ein minimales Fluoreszenzsignal ergeben, das sich vom Rauschen nicht mehr abhebt.

Aber dies ist eben nur ein scheinbarer Nachteil. Denn wir registrieren nun nicht mehr das zeitgemittelte stationäre Signal, sondern "legen uns auf die Lauer" und warten, bis eines der fluoreszierenden Moleküle in den Laserfokus eintritt. Es hält sich dort nur für einige Millisekunden oder weniger auf; aber in dieser Zeit sendet es eine "Salve" von einigen tausend Fluoreszenzlichtquanten aus. Diese werden mit einer Methode nachgewiesen, die der geschilderten Situation besonders angepasst und unter der Bezeichnung Autokorrelation bekannt ist. Man multipliziert dazu einfach die in zwei unmittelbar aufeinander folgenden Zeitintervallen aufgenommenen Intensitäten. Das Produkt ist nur dann von null verschieden, wenn beide Intensitäten ungleich null sind. Das trifft für eine "Salve von Lichtquanten" zu, im Allgemeinen aber nicht für den aus einzelnen Störsignalen bestehenden Rauschhintergrund. Dadurch hebt sich bei zeitaufgelöster Registrierung die Summe der Intensitätsprodukte für die gesamte Aufenthaltsdauer des Moleküls im Laserfokus deutlich vom Rauschhintergrund ab.

Die Apparatur besteht im Wesentlichen aus einem hochempfindlichen konfokalen Fluoreszenzmikroskop mit computergesteuerter Auswertung der autokorrelierten Signale. Diese Methode gestattet nicht nur, einzelne Moleküle sichtbar zu machen, sondern ermöglicht auch den empfindlichen Nachweis kleinster Konzentrationen – bis hinab in den femtomolaren Bereich, was rund einer Milliarde Teilchen pro Liter entspricht, und bei Anwendung einiger Tricks sogar noch darunter.

Die Autokorrelationsmethode arbeitet mit einem Fluoreszenzmarker, der an einer Substanz befestigt ist, die sich mit hoher Affinität an den nachzuweisenden Stoff anlagert und ihn so quasi mit einem leuchtenden Etikett versieht. Als solche Etiketten eignen sich vor allem monoklonale Antikörper, die sich spezifisch an Epitope (Abschnitte aus wenigen Aminosäuren) des PrP-Moleküls heften. Nun ist PrPsc ein relativ großes Protein-Aggregat, das viele PrP-Moleküle enthält und damit Platz genug zum Anheften vieler – auch unterschiedlicher – Etiketten bietet.

Das ermöglicht einen weiteren Trick, der die Nachweisempfindlichkeit noch steigert. Statt eines einzelnen monoklonalen Antikörpers benutzt man zwei, die sich gegen verschiedene Epitope der PrP-Moleküle richten und mit zwei unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind – der eine zum Beispiel mit einem roten und der andere mit einem grünen. Zudem ersetzt man die Autokorrelation durch eine Kreuzkorrelation. Sobald nämlich ein PrPsc-Aggregat in den Laserfokus gerät, tritt gleichzeitig ein starkes rotes und ein intensives grünes Signal auf. Ihre Koinzidenz ist ein eindeutiger Hinweis auf die Anwesenheit des infektiösen Prions. Irgendein anderes Einweißmolekül könnte vielleicht zufällig einen der beiden Antikörper anlagern, sodass entweder nur ein rotes oder nur ein grünes Signal erschiene, aber dass beide Marker gleichzeitig von einer falschen Zielstruktur gebunden werden, ist sehr unwahrscheinlich. Andererseits kann zwar ein normales PrPc-Molekül auch je einen roten und einen grünen Marker binden; da es aber nicht zu großen Aggregaten verklumpt, liefert es nur ein schwaches Signal.

In seiner Dissertation hat mein Mitarbeiter Jan Bieschke in Kooperation mit Armin Giese aus der Arbeitsgruppe von Hans Kretzschmar am Göttinger Universitätsklinikum (inzwischen an der Universität München) diese Kreuzkorrelation zu einer effektiven Methode der molekularen Diagnostik ausgearbeitet, die wir mit dem Kürzel SIFT (Scanning for Intensely Fluorescent Targets) bezeichnen. Mit ihr wurde die Rückenmarksflüssigkeit (der Spinalliquor) von Patienten untersucht, die an der Creutzfeldt-Jakob-Krankheit leiden.

Die Empfindlichkeit dieses Verfahrens übersteigt die des klassischen Nachweises für BSE wie der Western-Blot-Methode um das Zehn- bis Hundertfache. Das Kreuzkorrelationssignal ließ sich noch bis zu einer Verdünnung um den Faktor 250000 beobachten. Das entspricht einer Konzentration von Aggregaten von pico- bis femtomolar, also von einer Billion bis hinab zu einer Milliarde Teilchen pro Liter. Messungen dieser Art waren sowohl bei Creutzfeldt-Jacob- als auch bei Alzheimer-Patienten erfolgreich; Letztere leiden unter einer schweren Form von Altersschwachsinn, der gleichfalls durch das Auftreten von Proteinaggregaten charakterisiert ist – in diesem Falle handelt es sich allerdings nicht um Prionen, sondern um nicht infektiöse Beta-Amyloide.

Der Vorteil des SIFT-Verfahrens liegt – abgesehen von seiner hohen Empfindlichkeit – vor allem darin, dass es erstmals quantitative Messungen an zugänglichen Körperflüssigkeiten (wie dem Spinalliquor) gestattet. Damit wären auch BSE-Tests am lebenden Rind im Prinzip möglich. Allerdings dürfte die Entnahme von Rückenmarksflüssigkeit in diesem Falle eine komplizierte Prozedur sein, die eventuell eine Betäubung erfordert.



Gute Aussichten auf wirkliche Sicherheit für den Verbraucher

Was den Nachweis von BSE-Erregern in Rindern angeht, sind die Anforderungen allerdings extrem hoch. Es genügt nicht festzustellen, dass die Konzentration der pathologischen Prionen unterhalb der Nachweisgrenze eines bestimmten Testverfahrens liegt. Vielmehr muss sichergestellt sein, dass das Fleisch völlig frei von infektiösem Material ist. Schließlich wird man kaum Lebensmittel auf den Markt bringen können, die möglicherweise noch Krankheitskeime enthalten; sonst müsste bald jedes Rindersteak mit dem Vermerk gekennzeichnet sein: "Die EU-Gesundheitsminister: Der Verzehr von Rindfleisch ist lebensgefährlich". Damit komme ich zu der noch ungelösten Problematik.

Zwar sprechen alle bisher bekannten Nachweisverfahren bereits bei Konzentrationen von pico- bis nanomolar an, was für eine chemische Analyse schon eine äußerst hohe Empfindlichkeit ist. Dem entsprechen pro Kilogramm Substanz aber immer noch etwa eine Billion bis Billiarde molekulare Einheiten – also Mengen, die weit oberhalb jener 100000 PrPsc-Einheiten liegen, die ein infektiöser Keim enthält. Da hilft es auch nichts, dass unsere neuen Verfahren um ein bis zwei Größenordnungen empfindlicher sind als die bisherigen Standardmethoden. Wir können zwar einzelne Moleküle "sehen", aber wir müssen sie erst einmal innerhalb der riesigen Menge an körpereigenen Teilchen "aufstöbern".

Die Lösung wäre, möglicherweise vorhandene Keime künstlich zu vermehren, bis ihre Konzentration die Nachweisgrenze übersteigt. Bei Viren und Bakterien, deren "pathologische Potenz" in ihren Genen, also den Erbmolekülen RNA (Ribonucleinsäure) oder DNA (Desoxyribonucleinsäure), gespeichert wird, ist das heutzutage kein Problem. Mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR), deren Entdecker Karry B. Mullis dafür 1993 den Chemie-Nobelpreis erhielt, oder mit ähnlichen Verfahren, die auf der Replikation von RNA oder DNA basieren, lassen sich einzelne Moleküle exponentiell binnen kurzer Frist so weit vermehren, dass sie gebräuchlichen Analyseverfahren zugänglich sind.

Hier nun kommt die Kinetik der Vermehrung ins Spiel. Bei RNA und DNA lässt sich eine Verdoppelung charakteristischer Sequenzen im Sekunden- bis Minutentakt erreichen. Somit kann man in einer Probe, die nur eine einzige DNA-Zielsequenz enthält, binnen einer halben Stunde 30 Verdopplungen vornehmen und damit 230 oder rund eine Milliarde Kopien herstellen. Selbst wenn es für Prionen eine analoge Methode gäbe, würde eine solche Vermehrung auf Grund der oben beschriebenen Kinetik jeweils eine Zeit von der Größenordnung eines Jahres in Anspruch nehmen – es sei denn, man findet einen Weg, diese Reaktionen in vitro erheblich zu beschleunigen. Das liegt nach meiner Kenntnis des Reaktionsmechanismus durchaus im Bereich des Möglichen. Dabei lässt sich ausnutzen, dass die Aggregate hydrophob, al-so wassermeidend, sind und sich daher bevorzugt an Membranen anlagern. Und hier komme ich auf eine Aussage am Anfang des Artikels zurück: Die Lösung des BSE-Problems – falls es eine solche denn geben sollte – liegt in der sachgerechten Anwendung unserer Kenntnisse vom Mechanismus und der Kinetik der Prionen-Vermehrung.

Die Bestrebungen müssen dahin gehen, die Kinetik so zu beeinflussen, dass sich winzige Spuren des Erregers im Reagenzglas in kurzer Zeit zu nachweisbaren Mengen vervielfältigen lassen. Nur so kann es gelingen, eine Infektion schon im Anfangsstadium zu entdecken.

Auch die Frage, was ein Prion ist, erscheint nach den hier vorgestellten Überlegungen in einem neuen Licht. Das infektiöse Agens ist weder ein einzelnes isoliertes Proteinmolekül PrPsc noch ein definiertes Polymer von Protein-Einheiten. Vielmehr handelt es sich um eine Verteilung von – im Wesentlichen – eindimensionalen Protein-Aggregaten, die sich aus PrPsc-Molekülen zusammensetzen und durch einen definierten stationären Mittelwert der Kettenlängen charakterisiert sind. Die Größe der infektiösen Einheit hängt dabei nicht nur von der durchschnittlichen Kettenlänge ab. Vielmehr sind die Aggregate vermutlich an Membranen gebunden und treten demnach gewöhnlich als Verband in Erscheinung. Dieser stellt die kleinstmögliche Infektionsquelle dar.

Ansteckend sind lediglich die Endglieder der jeweiligen Ketten. Somit spielt für die Infektiosität auch eine maßgebliche Rolle, welche Zusammensetzung die Komponenten der Verteilung haben: Eine einzelne lange Kette von hunderttausend PrPsc-Einheiten ist nur ein tausendstel so ansteckend wie die gleiche Menge von PrPsc-Einheiten, die sich auf tausend Kettenstücke einer mittleren Länge von hundert verteilen. Die Zahl der "infektiösen" Ketten-Endglieder ist es, die ein exponentielles Wachstum aufrecht erhält.

Literaturhinweise


Molekulare Diagnostik. Von Manfred Eigen in: Das Gen und der Mensch (Hg. G. Gottschalk). Wallstein Verlag, 2000

Ultra-sensitive Detection of Pathological Prion Protein Aggregates by Dual-color Scanning for Intensely Fluorescent Targets (SIFT). Von J. Bieschke et al. in: Proceedings of the National Academy of Sciences (USA), Bd. 97, S. 5468 (2000)

Quantifying the Kinetic Parameters of Prion Replication. Von J. Masel, V. A. A. Jansen und M. A. Nowak in: Biophysical Chemistry, Bd. 77, S. 139 (1999)

Prionics. Von Manfred Eigen in: Biophysical Chemistry, Bd. 63, S. A1 (1996)

---

Steckbrief

Das Problem

Der BSE-Erreger hat eine äußerst lange Inkubationszeit. Erst Jahre nach der Infektion bricht der Rinderwahnsinn aus. Heutige BSE-Tests können frühestens sechs Monate vor dem Auftreten der ersten Symptome die Krankheit diagnostizieren. Auch davor ist ein infiziertes Rind aber wahrscheinlich schon ansteckend. Außerdem lassen sich heutige Tests nur an geschlachteten Tieren durchführen.

Kurzfristige Verbesserung

Ein neuartiges Nachweisverfahren, die so genannte Kreuzkorrelations-Fluoreszenz-Spektrometrie, ist zehn- bis hundertmal empfindlicher als die bisherigen Tests und im Prinzip auch an lebenden Rindern einsetzbar. Damit ließe sich die Erkrankung zumindest einige Monate früher entdecken.

Langfristiger Lösungsansatz

Eine genaue Analyse des Vermehrungsmechanismus von Prionen zeigt Möglichkeiten auf, eine BSE-Infektion von Anfang an zu erkennen. Das Prinzip besteht darin, die infektiösen Partikel vor dem Nachweis im "Reagenzglas" zu vermehren.

Aus: Spektrum der Wissenschaft 4 / 2001, Seite 40
© Spektrum der Wissenschaft Verlagsgesellschaft mbH