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Identifizierung eines Resitenzgens zum Schutz von Zuckerrüben gegen Fadenwürmer


Zu den vielen Krankheitserregern und Parasiten, welche die Zuckerrübe befallen und dadurch beträchtlichen wirtschaftlichen Schaden anrichten, gehört der Nematode Heterodera schachtii, ein Fadenwurm, der an den Wurzeln schmarotzt. Die Pflanze reagiert mit der Bildung eines bärtigen Wurzelgeflechts sowie mit vermindertem Wachstum. Eine Handvoll Kulturboden enthält meistens mehrere tausend Nematoden, deren Vermehrung seit dem Verbot chemischer Bekämpfungsmittel in Deutschland nur noch mit häufigem Fruchtartenwechsel oder zwischenzeitlicher Brache unterdrückt werden kann.

Diese Maßnahmen haben jedoch nur mäßigen Erfolg, weil die infektiöse Larve im Ei viele Jahre im Boden zu überdauern vermag. Erst wenn die Wurzel einer Wirtspflanze in ihrer Nähe wächst, wird sie zum Schlüpfen angeregt. Das mikroskopisch kleine Älchen dringt dann in die Wurzel ein und veranlaßt die Fusion mehrerer Zellen im Leitungsgewebe zu einem Syncytium (Bild 1), aus dem es mit einem speziellen Mundstachel Nährstoffe aufnimmt.

Beim weiteren Heranreifen differenzieren sich die Würmer in Männchen und Weibchen. Letztere schwellen stark an, lassen die Wurzelrinde platzen und strecken ihr aufgeblähtes Hinterende nach draußen, während der Kopf im Pflanzengewebe stecken bleibt. Sie werden von den inzwischen ausgewanderten Männchen befruchtet und bilden daraufhin jeweils 200 bis 500 Eier. Schließlich sterben sie ab, und ihr Körper verwandelt sich in eine stabile Dauerform, die zitronenförmige Cyste; mehrere hundert davon können an einer einzigen Pflanze entstehen. Da der gesamte Zyklus nur et-wa sechs Wochen dauert, kommt es zu einer starken Vermehrung im Verlaufe einer Vegetationsperiode.

Die Situation bei der Zuckerrübe ist insofern besonders ungünstig, als es keine nematodenresistente Sorte gibt. Ein Gen, das gegen die Fadenwürmer schützt, wurde nur in der weitläufig verwandten Wildrübenart Beta procumbens gefunden, die auf den Kanarischen Inseln heimisch ist. Vor 17 Jahren hat man begonnen, B. procumbens mit Zuckerrüben zu kreuzen. Nur mit viel Aufwand ließen sich lebensfähige Bastarde gewinnen. Diese wurden mehrfach mit Zuckerrüben zurückgekreuzt, um die Gene der Wildrübe, die mit Ausnahme der Nematodenresistenz keinerlei züchterisch interessanten Eigenschaften hat, zu verdrängen. Schließlich konnten einige wenige Pflanzen selektiert werden, die zwar resistent waren, in ihrer Leistungsfähigkeit jedoch zu wünschen übrigließen.

Deshalb haben wir vor sieben Jahren damit begonnen, das Resistenzgen aus einer der Bastardlinien mit gentechnischen Methoden zu isolieren. Es mußte mühsam über seine Position im Genom eingekreist werden, weil über das zugehöri-ge Protein nichts bekannt war. Als Ausgangspunkt diente die Beobachtung, daß die eingekreuzte Resistenz zusammen mit einem Chromosomenmarker (genauer: einem Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus, das heißt einem charakteristischen Spaltungsmuster bei Zugabe eines bestimmten Enzyms) der Zuckerrübe vererbt wurde, der sich dicht am Ende von Chromosom 9 befindet. Dort irgendwo mußte das Resistenzgen liegen (Bild 2).

Tatsächlich befanden sich an dieser Stelle auch Marker der Wildrübe: charakteristische, als Satelliten-DNA bezeichnete Wiederholungen einer kurzen Abfolge von DNA-Bausteinen (Nucleotiden), die über das gesamte Erbgut von B. procumbens verstreut sind. Mit ihrer Hilfe ließ sich die Länge des fraglichen Abschnitts zu etwa 300000 Nucleotiden bestimmen, was 0,04 Prozent der gesamten Erbinformation der Zuckerrübe entspricht. Dies erscheint zwar als wenig, doch umfaßt ein Gen im Durchschnitt nur 500 bis 4000 Nucleotide. Um in dem langen Abschnitt also das sehr viel kleinere Resistenzgen aufzufinden, spalteten wir ihn enzymatisch in Fragmente auf, welche wir zur weiteren Untersuchung in künstlichen Hefechromosomen (YACs, nach englisch yeast artificial chromosomes) vervielfältigten; für die einfachere Klonierung in Bakterien waren die Bruchstücke zu lang.

Anschließend machten wir uns daran, schlicht sämtliche aktiven Gene auf diesen Fragmenten zu lokalisieren – eines davon mußte schließlich das gesuchte sein. Aktive Gene zeichnen sich dadurch aus, daß sie in Boten-RNAs abgeschrieben werden, die dann als Blaupausen für den Zusammenbau der zugehörigen Proteine dienen. Wir isolierten deshalb sämtliche Boten-RNAs aus den Zellen der Bastardlinie und schrieben sie in DNA zurück. Die radioaktiv markierten DNA-Stücke dienten uns dann als Sonden für die zugehörigen Gene, da sie sich spezifisch nur mit diesen verbinden (hybridisieren) und so deren Position anzeigen. Wie sich herausstellte, lagerten sich lediglich drei dieser Sonden an die Fragmente des 300000 Nucleotide langen Abschnitts an. Insgesamt enthielt dieses Segment also nur drei aktive Gene, während das restliche Erbmaterial offenbar aus Steuersignalen oder schlicht sinnlosen Abschnitten bestand (die mehr als 90 Prozent des gesamten Erbguts höherer Lebewesen ausmachen können).

Welches davon aber war das gesuchte Resistenzgen? Um dies herauszufinden, brachten wir die drei Sonden mit den Genomen von Wild- und Zuckerrübe zusammen. Nur eine hybridisierte ausschließlich mit B. procumbens. Von den drei gefundenen Genen auf dem Ende von Chromosom 9 der Bastardlinie war also lediglich eines spezifisch für die Wildrübe. Dieses mußte somit das Resistenzgen sein.

Für den letzten Beweis übertrugen wir es auf kultivierte Wurzeln einer nematodenanfälligen Zuckerrübe. Dazu schleusten wir das Gen zunächst in Agrobacterium rhizogenes ein und infizierten mit diesem Mikroorganismus einzelne Blätter der Rübe. Das Bakterium bewirkt zweierlei: Es injiziert die Fremd-DNA in die Pflanzenzellen und integriert sie in deren Genom; zugleich regt es die Blattzellen dazu an, binnen weniger Tage in den Kulturschalen ein üppiges Wurzelwerk zu bilden (dieser Eigenschaft verdankt es auch den Namensbestandteil rhizogenes, was auf Deutsch wurzelbildend heißt). Tatsächlich zeigten diese Wurzeln die gleiche Resistenzreaktion gegen die Nematoden wie die Wildrüben, während sich die Fadenwürmer in Wurzeln, die von unveränderten A. rhizogenes induziert worden waren, ungehemmt vermehrten. Indem wir diesen Versuch mit Gewebekulturen durchführten, konnten wir fast zwei Jahre einsparen – so lange hätte es gedauert, komplette transgene Pflanzen zu erzeugen, anzubauen und zu testen.

Nachdem so erstmals ein Gen identifiziert worden ist, das Resistenz gegen Nematoden verleiht und das wir nach den Anfangsbuchstaben von Heterodera schachtii Hs1 genannt haben, läßt sich die Abwehr der Schmarotzer nun auf molekularer Ebene studieren. Die Pflanzenzelle erkennt bestimmte, bisher nicht bekannte Stoffe des Nematoden. Dies löst einen Reiz aus, der über eine Signalkaskade bis an den Zellkern weitergegeben wird und dort schließlich die Aktivierung des Resistenzgens bewirkt. Einen Hinweis auf die Wirkungsweise von Hs1 geben einige charakteristische Ähnlichkeiten zwischen dem zugehörigen Protein und den Eiweißprodukten anderer pflanzlicher Resistenzgene, von denen bekannt ist, daß sie an der Weitergabe von Signalen innerhalb der Zelle beteiligt sind, indem sie mit weiteren Proteinen in Kontakt treten. So weist es wie diese in einem bestimmten Abschnitt eine regelmäßige Abfolge der Aminosäure Leucin auf.

Die Resistenz selbst beruht darauf, daß die Nematodenlarven daran gehindert werden, ihren Lebenszyklus in der Wurzel zu vollenden. Zwar vermögen sie noch in das Gewebe einzudringen, aber es bilden sich keine ausgedehnten Syncytien (Bild 1 links). Damit können sich zwar noch Männchen, aber keine Weibchen mehr entwickeln, die höhere Ansprüche an die Versorgung mit Nährstoffen stellen.

Nachdem das Resistenzgen bekannt und kloniert ist, kann man es auch nach einem etablierten Verfahren mittels Agrobacterium tumefaciens in leistungsfähige Zuckerrüben einschleusen und danach Pflanzen selektieren, die vollständig gegen den Parasiten gefeit sind. Dies bedeutet einen großen Fortschritt für die Pflanzenzüchtung. Während die Übertragung eines Gens durch Kreuzung und Selektion ebenso arbeits- wie zeitaufwendig ist und auch nach Jahrzehnten nicht unbedingt ein befriedigendes Ergebnis liefert, können nun innerhalb weniger Jahre resistente Rüben gezüchtet werden. Ihr Anbau sollte einen bedeutenden wirtschaftlichen Nutzen bringen.


Aus: Spektrum der Wissenschaft 11 / 1997, Seite 14
© Spektrum der Wissenschaft Verlagsgesellschaft mbH
11 / 1997

Dieser Artikel ist enthalten in Spektrum der Wissenschaft 11 / 1997

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