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DNA-Analyse: Zweckentfremdete Membranpore sequenziert DNA

Nanopore zur DNA-Sequenzierung
Die Idee, Erbsubstanz durch winzige Kanäle hindurch- und an einem Detektor vorbeizuschleusen, ist als Alternative zu den herkömmlichen Sequenzierungsverfahren bereits länger im Gespräch. Sollte sich das Verfahren als praxistauglich erweisen, könnte DNA eines Tages weitaus schneller und günstiger gelesen werden, als dies derzeit möglich ist. Noch aber wetteifern Forscher um das beste Verfahren und die ideale Pore.

Nanopore zur DNA-Sequenzierung | Das Protein MspA (Mycobacterium smegmatis Porin A) hat eine rund 1,2 Nanometer große Öffnung, durch die die DNA gefädelt wird. An der Änderung des Ionenstroms lesen Forscher ab, welche Base gerade die Engstelle passiert.
Aus dem Bakterium Mycobacterium smegmatis, einem verbreiteten Labororganismus, isolierten Wissenschaftler um Jens Gundlach von der University of Washington in Seattle bereits im vergangenen Jahr einen Kanal, der sich ihrer Meinung nach hervorragend für diese Aufgabe eignet. Zunächst mussten dazu allerdings drei Aminosäuren des verwendeten Porenproteins Porin A mittels Gentechnik ersetzt werden, um die im Durchmesser knapp anderthalb Nanometer messende Engstelle der Pore elektrisch neutral zu gestalten.

Anschließend integrierten Gundlach und Kollegen den Kanal – wie bei dieser Technik üblich – in eine künstliche Membran und legten eine niedrige elektrische Spannung an, die Ionen und das zu analysierende DNA-Stück durch die Pore auf die andere Seite treibt. Dabei ändert sich der Ionenfluss messbar, je nachdem welche Nukleinbase gerade die Engstelle passiert.

Die größte Herausforderung bei dieser Technik ist die Tatsache, dass innerhalb einer Sekunde annähernd eine Million Basen die Pore durchqueren können – weit mehr, als vom Messgerät aufgelöst werden können. Gundlach und Team stellen nun einen Trick vor, mit dem sich die Geschwindigkeit erheblich herabsetzen lässt: Da ausschließlich einzelsträngige DNA-Ketten durch die Engstelle passen, fügten sie zwischen jeder einzelnen Base der zu untersuchenden Sequenz einen doppelsträngigen Abschnitt ein. Eine weitere Kette am Anfang der Sequenz diente als Einfädelhilfe.

Gezieltes Verstopfen | In einem ersten Versuch experimentierten die Forscher mit einem DNA-Strang, dessen Ende zu einer haarnadelartigen Schleife zusammengebunden war. Dieses dann doppelsträngige Ende wirkte wie die Stopp-Ketten im eigentlichen Experiment: Es hinderte die DNA lange genug am Durchrutschen, um eine Messung durchzuführen, und positionierte dabei die interessierende Base in der Engstelle.
Beim Lesevorgang stoppte der DNA-Strang, sobald ein doppelsträngiger Abschnitt die Pore blockierte. An der entscheidenden Engstelle befand sich nun die gerade zu erfassende Base, wo sie sich für rund 10 Millisekunden auf den Ionenfluss auswirkte – lange genug für eine Messung, dann trennte der Druck den komplementären Strang ab, und die nun einzelsträngig gewordene Sequenz rutschte weiter durch den Kanal bis zur nächsten Stopp-Kette.

Dieses Verfahren schränkt die praktische Verwertbarkeit der Technik erheblich ein, da die Vorbereitung der Ausgangssequenz geraume Zeit beansprucht, weshalb die Wissenschaftler ihre jüngsten Untersuchungen als reine Demonstration der Machbarkeit auffassen. Das eigentliche Forschungsziel sei es, die unveränderte Ausgangs-DNA mit Hilfe der Pore zu analysieren. (jd)

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  • Quellen
Derrington, I. et al.: Nanopore DNA Sequenzing with MspA. In: Proceedings of the National Academy of Sciences 10.1073/pnas.1001831107, 2010.

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