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Lexikon der Biologie: Autoradiographie

Autoradiographie w [von *auto –, latein. radius = Strahl, griech. graphein = schreiben], photographisches Verfahren zum Nachweis und zur Charakterisierung radioaktiver Stoffe (Radioaktivität), entweder direkt in mikroskopischen Schnittpräparaten (Mikroautoradiographie) oder nach Auftrennung durch papierchromatographische, elektrophoretische und andere Methoden (Chromatographie, Elektrophorese). Die zur Autoradiographie am häufigsten eingesetzten radioaktiven Isotope sind 3H (Tritium), 14C (Kohlenstoff), 35S (Schwefel) und 32P (Phosphor). Übliche Vorläufer, deren in-vitro- oder in-vivo-Umsetzungen durch Autoradiographie gemessen werden, sind z. B. 3H-Thymidin (in-vivo-DNA-Synthese), 3H-, 14C- oder 32P-Desoxyribonucleosidtriphosphate (in-vitro-DNA-Synthese und DNA-Sequenzierung), 3H-Uridin, 3H-Cytidin (in-vivo-RNA-Synthese), 3H-, 14C- oder 32P-Ribonucleosidtriphosphate (in-vitro-RNA-Synthese), 3H-Leucin, 35S-Methionin bzw. 14C-Aminosäuren (Proteinsynthese). Zur Sequenzierung von DNA bzw. RNA werden 32P-Phosphatreste (z. B. durch Übertragung eines γ-32P-Phosphatrests von ATP) selektiv in die endständigen Nucleotidpositionen eingeführt. Im Falle von papierchromatographischer bzw. gelelektrophoretischer Auftrennung (Gelelektrophorese) radioaktiver Produkte verursachen diese in einem über dem Papierchromatogramm bzw. Gel aufgelegten Film ein entwickelbares Muster von Schwärzungen, das als Autoradiogramm bezeichnet wird. Zur optimalen Schwärzung müssen 106–108 Elektronen pro cm2 Film auftreffen. Eine gerade noch sichtbare Schwärzung wird mit 105 Elektronen pro cm2 Film erreicht. Das Signal kann durch Verwendung fluoreszierender Chromophore (chromophore Gruppen, Fluoreszenz) um mehrere Größenordnungen gesteigert werden. Nach der elektrophoretischen Auftrennung von Makromolekülen, die mit weichen β-Strahlern (Betastrahlen) wie 3H oder 14C markiert sind, verstärkt die Einlagerung von Verbindungen wie PPO (2,5-Diphenyloxazol) in das Gel die Schwärzung des Films erheblich, da das PPO durch die Isotope zur Fluoreszenz angeregt wird. Bei energiereicheren Isotopen wie 32P und 125I sowie bei γ-Strahlung (Gammastrahlen) ergibt sich das Problem, daß diese den Film einfach durchdringen. Befindet sich jedoch auf der gegenüberliegenden Seite ein sog. Verstärkerschirm mit einem Fluorophor, so wird der Film durch das von diesem ausgestrahlte Licht verstärkt geschwärzt. Autoradiogramme zeigen besonders hohe Auflösung, wenn die zugrundeliegenden Trennmethoden zweidimensional durch Kombination entsprechender Trennverfahren (z. B. Papierchromatographie, Dünnschichtchromatographie oder Elektrofokussierung in der 1. Dimension, Papier- oder Gelelektrophorese in der 2. Dimension; zweidimensionale Gelelektrophorese) durchgeführt werden. Die entstehenden Autoradiogramme werden je nach Art der aufgetrennten radioaktiven Stoffe als Peptid-, Protein-, Nucleotid- usw. -Fingerprint bezeichnet (Fingerprint-Analyse, DNA-fingerprinting). – Autoradiographie ist in Kombination mit den entsprechenden Trennverfahren von großer analytischer Bedeutung für praktisch alle biologisch wichtigen Substanzklassen, besonders aber für die Analyse komplexer Peptid- und Proteingemische und für die Sequenzanalyse von DNA ( vgl. Abb. ) und RNA. Bei der historisch älteren Mikroautoradiographie werden die als niedermolekulare Vorstufen dienenden Stoffe (z. B. Aminosäuren, Nucleoside) in 3H-markierter Form (Markierung) an Zellen (oder ganze Organismen) verfüttert und letztere nach verschieden langen Zeiten fixiert und histologisch aufgearbeitet. Die histologischen Schnittpräparate werden dann mit einer Filmemulsion überzogen und für eine gewisse Zeit im Dunkeln exponiert. Bei dieser Autoradiographie entstehen durch die radioaktive Strahlung bestimmter Objektbereiche reduzierte Silberhalogenide in der Photoemulsion, die beim anschließenden photographischen Entwicklungsprozeß als Silberkörnchen ("grains") sichtbar werden, ganz analog der Belichtung eines Kamerafilms. Bei der mikroskopischen Auswertung der Autoradiogramme kann man nun sowohl die grains als auch (nach entsprechender histologischer Übersichtsfärbung) die darunterliegenden Zellstrukturen (die "Strahlungsquellen") erkennen. Verfüttert man z. B. radioaktiv markierte RNA-Vorstufen für kurze Zeit an Zellen und fixiert schon nach wenigen Minuten, so findet man fast alle Körnchen über den Zellkernen bzw. über den Puffs von Riesenchromosomen. Dies erlaubt den Schluß, daß dort die RNA-Synthese aus den Vorstufen erfolgt. Fixiert man die Zellen erst nach längeren Zeiträumen, so treten immer weniger grains über den Kernen und immer mehr über dem Cytoplasma auf. Die Autoradiographie erlaubt sozusagen durch die Aufnahme statischer Schnappschüsse in zeitlicher Sequenz, dynamisch verlaufende, biochemische Prozesse in der Zelle zu beschreiben. Autoradiographie ist auch an elektronenmikroskopischen Präparaten (Elektronenmikroskop) möglich, jedoch werden hier spezielle Anforderungen an die Photoschicht und den Energiebereich des β-Strahlers gestellt (monomolekulare Silberbromidschicht, "weiche", z. B. sog. Auger-Elektronen). Klassische Beispiele für die Anwendung der Mikroautoradiographie sind der Nachweis der semikonservativen DNA-Replikation (Farbtafel Replikation der DNA I–II) (Taylor, 1957; Vicia-Gewebekulturzellen) sowie die Identifikation des rauhen endoplasmatischen Reticulums als Syntheseort der Exportproteine (Exportproteinsynthese) (Palade, 1961; exokrines Pankreas des Meerschweinchens). – Inzwischen verdrängt die Markierung von Molekülen mit fluoreszierenden Chromophoren (z. B. FITC = Fluoresceinisothiocyanat, Fluorescein) wegen der leichteren Handhabung die Autoradiographie aus vielen traditionellen Anwendungen. Die Immunfluoreszenz ermöglicht z. B. die nicht-radioaktive Detektion von Proteinen auf mikroskopischen Schnittpräparaten oder nach deren Transfer auf eine Membran im Anschluß an eine chromatographische und elektrophoretische Auftrennung. DNA und RNA können in Geweben durch die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung nachgewiesen werden, indem man entsprechende Sonden vorab mit Markermolekülen wie Biotin oder Digoxigenin verknüpft, die ihrerseits von einem mit Fluoreszenzfarbstoff versehenen Antikörper erkannt werden. Ähnlich verläuft der Nachweis von DNA und RNA, die nach elektrophoretischer Auftrennung auf Membranen transferiert wurden. Fluorochrome kommen zudem immer häufiger bei der Sequenzierung von DNA, RNA (Fluoreszenz-Sequenzierung) sowie Proteinen (Fluorescamin) zum Einsatz. Eine weitere, inzwischen weit verbreitete Alternative ist die Anwendung der Chemilumineszenz, wobei in der Regel spezifische Antikörper mit Substanzen gekoppelt sind, die entweder durch eine chemische (Luminol) oder enzymkatalysierte Reaktion (AMPPD oder CSPD) zur Emission von Licht gebracht werden. Historadiographie, Hybridisierung, Immunassays, in-situ-Hybridisierung, Isotope, Proteine, Ribonucleinsäuren.

B.L./H.K./M.B.




Autoradiographie

Autoradiographie eines DNA-Sequenzierungsgels
Die von radioaktiv markierter DNA durch vier basenspezifische Reaktionen erhaltenen Fragmentgemische (DNA-Sequenzer, Sequenzierung) wurden durch Elektrophorese in einem Polyacrylamidgel (Polyacrylamid-Gelelektrophorese) nach wachsender Größe getrennt (Laufrichtung von oben nach unten, von oben nach unten abnehmende Kettenlängen der DNA-Fragmente). Nach der Auftrennung werden die Positionen der radioaktiven Fragmente durch die Schwärzungen des aufgelegten Röntgenfilms sichtbar (Autoradiogramm). Die mit G indizierte Spur zeigt die Reihenfolge der an den Guanylsäureresten gespaltenen Fragmente an, die mit A>C indizierte Spur die Reihenfolge der an den Adenylsäureresten und in geringerem Maße an den Cytidylsäureresten gespaltenen Fragmente, während die mit C bzw. C+T indizierten Spuren die Reihenfolge der an den Cytidylsäureresten bzw. an den Cytidylsäure- und Thymidylsäureresten gespaltenen Fragmente wiedergeben. Die Nucleotidsequenz der DNA (am rechten Rand des Autoradiogramms wiedergegeben) kann so direkt aus dem aufsteigenden Bandenmuster der vier Bahnen abgelesen werden.

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