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Lexikon der Biologie: CASTing

CASTing, Abk. für cyclic amplification and selection of targets, ein auf der PCR-Technik (Polymerase-Kettenreaktion) beruhendes Verfahren, mit dessen Hilfe die Sequenzen der Bindestellen von Proteinen, die als DNA-bindende Proteine bekannt sind, deren Zielsequenzen man jedoch nicht kennt, ermittelt werden können. Hierbei werden die gereinigten Proteine z. B. an einer Matrix immobilisiert und mit einem statistisch zusammengestellten Gemisch von Oligonucleotiden inkubiert, welche jedoch alle an ihren Enden die gleichen Sequenzen beinhalten (sie besitzen also nur jeweils in ihrer Mitte für sie charakteristische Nucleotidabfolgen). Nach erfolgter Bindungsreaktion eines oder weniger dieser Oligonucleotide an die Proteine werden in einem ersten Schritt die nicht von den Proteinen gebundenen Oligonucleotide entfernt; sodann werden die gebundenen Oligonucleotide von den Proteinen abgelöst. Diese so selektierte Population von Oligonucleotiden kann nun durch die Polymerase-Kettenreaktion aufgrund ihrer ihnen allen gemeinsamen Endsequenz mit für nur diese Endsequenz spezifischen anderen Oligos amplifiziert werden. Dieses amplifizierte Gemisch wird meist noch mehrmals (4–8mal) der gleichen Prozedur (Bindung an die Proteine/Waschung/Ablösung und Sammlung der spezifisch gebundenen Oligos) unterworfen, um spezifisch gebundene Oligonucleotide weiter anreichern zu können. Die so aus der ursprünglichen Vielzahl vorliegender Oligonucleotide selektierte Subpopulation kann (unter Zuhilfenahme der allen gemeinsamen bekannten Enden) kloniert und sequenziert werden. Durch die Sequenzanalyse einer Vielzahl von erhaltenen Klonen kann eine Consensus-Bindestelle für die untersuchten DNA-bindenden Proteine ermittelt werden.

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