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Lexikon der Biologie: Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie

Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie w, Abk. FCS, ein von R. Rigler und M. Eigen entwickeltes, höchstempfindliches optisches Analyseverfahren zur Untersuchung von Molekülbeweglichkeiten sowie zum Nachweis geringster Konzentrationen fluoreszierender bzw. fluoreszenzmarkierter Substanzen ( vgl. Infobox ). Bei der FCS wird ein Laserstrahl in ein Auflichtmikroskop (Auflichtmikroskopie) eingespiegelt und über das Objektiv auf einen Bereich mit einem Rauminhalt von unter 1 Femtoliter (10–15 Liter) fokussiert (abhängig von Objektivvergrößerung, numerischer Apertur und Wellenlänge des verwendeten Laserlichtes). Das Meßvolumen ist so winzig, daß sich im zeitlichen Mittel kein nachzuweisendes Teilchen darin befindet. Wandern nachzuweisende Partikel durch Diffusion oder Brownsche Molekularbewegung in das Fokusvolumen, werden sie für die Dauer der mittleren Aufenthaltszeit von wenigen Millisekunden zur Fluoreszenz angeregt (Anregung). Ein mit dem Mikroskop verbundener Detektor registriert die in dieser Zeit ausgesandten Fluoreszenzphotonen. Durch die extrem geringe Anzahl tatsächlicher Fluoreszenzereignisse muß dafür Sorge getragen werden, daß der Rauschhintergrund auf ein Minimum reduziert wird. Um dies zu gewährleisten, sollten nur Photonen nachgewiesen werden, die zeitlich korreliert sind. Dies wird durch eine dem Photonendetektor nachgeschaltete elektronische Koinzidenzschaltung erreicht, die nur solche Signale passieren läßt, die innerhalb eines gewissen „Zeitfensters“ (entsprechend der mittleren Aufenthaltszeit der Partikel) liegen. Um die Genauigkeit des Verfahrens weiter zu erhöhen, werden die einzelnen nachzuweisenden Partikel für die Dauer des Nachweises in „elektrischen Fallen“ gefangen. Heute werden oft mehrere Fluoreszenzmarker (Fluoreszenzmarkierung) gleichzeitig über mehrere Antigen-Antikörper-Reaktionen an die nachzuweisenden Zielstrukturen gebunden. Die korrelierte Registrierung mehrerer Wellenlängen (Kreuzkorrelation) ermöglicht einen besonders empfindlichen Nachweis. Das gegen zufällige Fluoreszenzphotonen aus dem Hintergrund weitgehend abgesicherte Meßverfahren der FCS läßt Beobachtungsdauern von einigen Stunden zu. Auf diese Weise können Partikel in Konzentrationen von bis hinab zu 10–15 Mol pro Liter nachgewiesen werden, womit man um Größenordnungen jenseits dessen messen kann, was mit gängigen, bisher genutzten Methoden erreichbar war: Ein Zuckerwürfel, aufgelöst im Starnberger See, wäre mit der FCS noch nachweisbar! Dies entspricht einer Verdünnung von 1:1 Billiarde (1 ppq = part per quadrillion).

R.Kü./M.B.



Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie

Abhängigkeit der Intensität der Fluoreszenzstrahlung von Fura-2 von der Anregungswellenlänge und der Teilchenkonzentration (Ca2+-Ionen)

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