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Lexikon der Biologie: in-situ-PCR

in-situ-PCR w, in-situ-Polymerase-Kettenreaktion, Kombination der in-situ-Hybridisierung mit der Polymerase-Kettenreaktion (PCR). In Paraffin eingebettete Gewebeschnitte werden auf Objektträgern fixiert und anschließend einer Behandlung mit Proteasen unterzogen, um die Nucleinsäuren für die anschließende PCR freizulegen ( vgl. Abb. ). Die Sichtbarmachung der gewünschten Nucleinsäure kann nach Beendigung der Amplifikationsreaktion entweder indirekt über eine folgende normale in-situ-Hybridisierung oder, falls Digoxigenin-dUTP im Rahmen der PCR in die neu synthetisierte DNA eingebaut wurde, direkt in einem Immunassay erfolgen (DIG-System; Digoxigenin). Die in-situ-PCR bietet aufgrund höherer Nachweisempfindlichkeit gegenüber der in-situ-Hybridisierung die Möglichkeit, die Verteilung bestimmter Nucleinsäuren, z.B. den Werdegang viraler DNA bzw. RNA in einer Zelle, zu beobachten, und verspricht somit wertvolle Einblicke in zelluläre und histologische Vorgänge.



in-situ-PCR

a Ein Gewebeschnitt wird auf einem mit Bindesilan beschichteten Objektträger fixiert. Mit Proteaselösung werden im Gewebe befindliche Proteine „abgedaut“ und damit die Nucleinsäuren freigelegt. b Entfernung der Proteaselösung; der Gewebeschnitt wird mit Amplifikationslösung überschichtet und mit einem Deckglas, das an einer Seite mit Nagellack am Objektträger arretiert wird, versehen. c Zur besseren Wärmeleitung wird der Objektträger mit Gewebeschnitt auf einem Aluminiumplättchen angebracht und auf einem PCR-Thermoblock befestigt. Bei 60 C (hot start) wird nach leichtem Anheben des Deckglases thermostabile DNA-abhängige DNA-Polymerase (z.B. Taq-DNA-Polymerase) zur Amplifikationslösung zugegeben. Anschließend wird mit Mineralöl als Verdunstungsschutz überschichtet und eine PCR durchgeführt.

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