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Lexikon der Biologie: run-off-Transkription

run-off-Transkription w, run-off-Experimente, molekularbiologische Analysemethode, bei der die Eigenschaft von RNA-Polymerasen ausgenutzt wird, nicht selbst zur Termination der Transkription befähigt zu sein. So können z.B. a) in vitro definierte DNA-Fragmente als Matrize für eine zugesetzte RNA-Polymerase angeboten werden, so daß RNA hergestellt wird, wenn die DNA-Fragmente einen aktiven Promotor haben (Prinzip der in-vitro-Transkription). Die RNA kann im folgenden isoliert und z.B. durch Gelelektrophorese analysiert werden ( vgl. Abb. ). Die Länge der hergestellten RNAs wird zum einen durch den Transkriptionsstart bestimmt, zum anderen durch das bekannte Ende der DNA-Fragmente, von dem die Polymerase „herunterläuft“ (run-off). Damit kann – alternativ zur S1-Kartierung – die Startstelle der Transkription relativ genau eingegrenzt werden. b) Eine weitere Anwendung der run-off-Transkription besteht in der Möglichkeit, isolierte Zellkerne auf Transkriptionsaktivität zu testen, indem man DNA-Fragmente mit aktivem Promotor anbietet. RNA-Polymerasen dieser Kerne transkribieren damit RNAs, die in einer RNA-Präparation durch Hybridisierung (nach Art der Northern-Technik; blotting-Techniken) nachgewiesen werden. Der gleiche experimentelle Ansatz kann auch dazu genutzt werden, mit bekanntermaßen transkriptionsaktiven isolierten Zellkernen verschiedene DNA-Fragmente im homologen zellfreien System auf Promotoraktivität zu untersuchen. Mittels gentechnischer Methoden (Gentechnologie) kann man außerdem Zellen mit Test-Fragmenten transformieren (Transformation), um Promotoraktivitäten auch in vivo durch run-off-Transkription zu analysieren.



run-off-Transkription

Prinzip der run-off-Transkription: Eine Reihe von DNA-Fragmenten wird eingesetzt, um diese auf Promotoraktivität zu testen. Nur von den Fragmenten, die einen aktiven Promotor besitzen, werden Transkripte durch RNA-Polymerasen hergestellt. Die Startstelle der Transkription kann durch Bestimmen der genauen Länge der RNAs ermittelt werden. Im gezeigten Beispiel muß sich der Promotor auf dem zwischen den Punkten 1 und 4 gelegenen DNA-Abschnitt befinden, da Fragment C kein Transkript liefert. Eine genauere Eingrenzung der Startstelle kann durch die Bestimmung der genauen Länge der Transkripte von A und B erfolgen.

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