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Chaperonin-60: ein Faß mit Fenstern

Wie falten sich die Aminosäureketten der frisch synthetisierten Proteine in der Zelle zu ihrer korrekten, kompliziert verknäulten dreidimensionalen Struktur? Mit der ersten erfolgreichen Röntgenstrukturanalyse eines Proteins, das bei diesem Vorgang assistiert, ist man der Antwort erheblich näher gekommen. Bis zur Aufklärung des genauen Mechanismus fehlen jedoch noch viele kleine Schritte.

Proteine können die ihnen zugedachte Aufgabe nur erfüllen, wenn sich die lange Aminosäurekette, aus der sie bestehen, in einem bestimmten Muster aus Schleifen und Windungen zusammenlegt. Bei diesem diffizilen Faltungsprozeß leisten andere Proteine, die sogenannten Chaperone, wichtige Hilfestellung. Eine der bestuntersuchten molekularen Anstandsdamen (so die Bedeutung des englischen Wortes chaperon) ist das Chaperon-60 (Cpn-60). Obwohl in den letzten Jahren viel über seine Funktionsweise in Erfahrung gebracht worden war (Spektrum der Wissenschaft, März 1994, Seite 16), erhoffte man sich wesentliche zusätzliche Hinweise von der Struktur der Substanz.

Sie zu ermitteln erwies sich freilich als äußerst schwieriges, ja hoffnungsloses Unterfangen. Mehrere Arbeitsgruppen in aller Welt haben versucht, von Cpn-60 Kristalle zu züchten, die sich zur Röntgenstrukturanalyse eignen; doch wegen der siebenzähligen Drehsymmetrie der Doppelring-Struktur, die aus elektronenmikroskopischen Untersuchungen schon länger bekannt war, passen die Moleküle nicht zusammen und zeigen wenig Neigung, sich in einem regelmäßigen Gitter anzuordnen. Andererseits ist für Strukturuntersuchungen der gelösten Substanz mittels kernmagnetischer Resonanzspektroskopie (NMR, nach englisch nuclear magnetic resonance) bereits eine einzelne der 14 Untereinheiten mit einem Molekulargewicht von 57200 um den Faktor zwei bis drei zu groß.

Durch einen glücklichen Umstand gelang der Arbeitsgruppe von Arthur L. Horwich an der Yale-Universität in New Haven (Connecticut) nun jedoch das fast unmöglich Scheinende. Bei dem Versuch, die von dem Bakterium Escherichia coli produzierte Menge an Cpn-60 durch Genmanipulation zu erhöhen, erhielten die Forscher eine Variante, bei der zwei Aminosäuren abgewandelt waren; obwohl sie sich in ihrer Funktion nicht von der normalen Version des Proteins unterschied, lieferte sie überraschend gute Kristalle. (Da jede der 547 Aminosäuren in der Sequenz von Cpn-60 durch 19 andere ersetzt werden kann, gibt es 10393 mögliche Punkt- und 108 Millionen Doppelmutationen.)

Als weitere günstige Fügung erwies es sich, daß Horwichs Institutsnachbar der Proteinkristallograph Paul B. Sigler ist. Und so konnte "Nature" im vergangenen Oktober auf dem Titelblatt die röntgenographisch bestimmte Molekülstruktur von Cpn-60 präsentieren (Band 371, Heft 6498; der zugehörige Artikel beginnt auf Seite 578).

In Übereinstimmung mit den bisherigen Ergebnissen elektronenmikroskopischer und biochemischer Untersuchungen ist das Molekül ein faßartiges Gebilde aus zwei Ringen, die je sieben identische Einheiten (Monomere) enthalten. Diese erweisen sich in der höheren Auflösung freilich als so stark gekrümmt, daß zwischen ihnen jeweils ein Loch bleibt (Bild 1). Es ist an der engsten Stelle ungefähr zwei Nanometer (millionstel Millimeter) lang und einen Nanometer breit und erlaubt Wassermolekülen den Eintritt ins Faß-Innere, wo man das gebundene Substratprotein vermutet. Am Rande dieser Fenster befindet sich auch die Bindungsstelle für die Energieträgersubstanz Adenosintriphosphat (ATP), die anhand von Mutationsexperimenten in der Sequenz lokalisiert werden konnte.

Bemerkenswert ist ferner, daß die beiden Enden des Aminosäurestrangs einer jeden Untereinheit sich offenbar in der Mitte des Fasses befinden. Sie sind zwar zu beweglich und ungeordnet, um in der Kristallstruktur identifizierbar zu sein, aber die nächsten noch lokalisierbaren Aminosäuren gehören alle zur äquatorialen Domäne und weisen ins Innere. Eventuell bilden die insgesamt 28 losen Enden in der Mittelebene einfach ein großes Knäuel, das den Zusammenhalt der ganzen Struktur sichern hilft.

Nachdem nun das Aussehen der molekularen Anstandsdame im Detail bekannt ist, sollte sich auch leichter klären lassen, wie sie ihre Aufgabe erfüllt. Bekannt ist, daß Cpn-60 nicht nur die Faltung des Substratproteins fördert, sondern in einem damit gekoppelten Prozeß zugleich ATP in Adenosindiphosphat und anorganisches Phosphat spaltet (hydrolysiert). Dieser ATPase-Funktion ist man schon recht dicht auf der Spur. So konnte die ATP-Bindungsstelle identifiziert werden, und die Teams von Horwich und Sigler sind gerade dabei, die Kristallstruktur der mit ATP beladenen Form des Proteins zu bestimmen. Aus elektronenmikroskopischen Untersuchungen des Chaperonins mit und ohne ATP schlossen Helen Saibil und ihre Mitarbeiter am Birkbeck-College in London, daß die Bindung des Nucleotids eine Öffnungsbewegung der randständigen (apikalen) Domänen auslöst ("Nature", Band 371, Heft 6494, Seite 261).

Schwieriger ist dagegen die Frage, was das Cpn-60 mit dem Substratprotein macht. Selbst wenn die Kristallisation eines Komplexes aus Chaperonin und gebundenem Substrat gelänge, wäre letzteres nach den bisherigen Erkenntnissen höchstwahrscheinlich zu ungeordnet, als daß es sich scharf abbilden ließe. Und die NMR-Spektroskopie scheitert hier erst recht an dem zu hohen Molekulargewicht des Komplexes.

Um seine Struktur zu bestimmen, haben wir deshalb in Oxford im Rahmen eines Projekts unter Federführung von Sheena E. Radford einen neuen Ansatz gewählt. Dabei analysieren wir den Austausch zwischen den Wasserstoff-Isotopen H (normaler Wasserstoff mit dem Molekulargewicht 1) und D (Deuterium, Molekulargewicht 2). Wo das Substratprotein nicht gefaltet ist, lassen sich nämlich insbesondere die an die Stickstoffatome des Peptid-Rückgrats gebundenen Wasserstoffatome (Amid-Protonen) sehr leicht austauschen. In gefalteten Regionen bilden sie dagegen Wasserstoffbrücken zu den Sauerstoffatomen des Peptid-Rückgrats, weswegen der Austausch – wenn überhaupt – 10000- bis 100000mal langsamer stattfindet.

Die Austauschgeschwindigkeit kann man mit verschiedenen Methoden messen. Bereits Anfang der fünfziger Jah-re ließ Kaj Linderström-Lang am Carlsberg-Laboratorium in Kopenhagen Tröpfchen des von der Probe absublimierten Wassers in eine halbmeterhohe Röhre mit einem Dichtegradienten aus zwei organischen Lösungsmitteln einsinken. Aus der Höhe, in der die Tröpfchen ins Schwebegleichgewicht kamen, konnte er die Dichte der Lösung und somit das Verhältnis von schwerem zu leichtem Wasserstoff erschließen.

Heute verwendet man dagegen meist die sogenannte zweidimensionale NMR-Spektroskopie (Spektrum der Wissenschaft, Dezember 1991, Seite 24). Weil sie ortsspezifisch ist, lassen sich damit – zumindest bei kleinen Proteinen – die Austauschgeschwindigkeiten einzelner Amid-Protonen getrennt ermitteln. Ergänzend dazu liefert die Massenspektrometrie Aussagen über die Gesamtmasse jedes einzelnen Moleküls und damit über seinen Deuterierungsgrad. Somit kann man etwa herausfinden, daß zu einem bestimmten Zeitpunkt 60 Prozent der Moleküle in der Probe je 20 Deuteronen enthalten und 20 Prozent je 95. Durch Kombination dieser beiden Methoden ließ sich unter anderem feststellen, daß sich Lysozym-Moleküle aus Hühnereiweiß auf verschiedenen Wegen falten.

Der Komplex aus Cpn-60 und daran gebundenem Substratprotein ist allerdings so groß, daß er bei der herkömmlichen Massenspektrometrie zerfällt, wenn er ionisiert und in das Hochvakuum injiziert wird. Das erst Ende der achtziger Jahre entwickelte Verfahren der Elektrospray-Ionisation erlaubte uns jedoch überraschenderweise, den intakten Komplex in den Gaszustand zu überführen, wo er sich erst nach dem völligen Abdampfen des Lösungsmittels in Substrat und Cpn-Untereinheiten trennt (Bild 2).

Wir konnten so zeigen, daß das an Cpn-60 gebundene Substrat (in diesem Falle a-Lactalbumin aus Kuhmilch) keineswegs, wie manchmal behauptet wurde, gänzlich unstrukturiert ist ("Nature", Band 372, Heft 6507, Seite 646). Vielmehr sind die Amid-Protonen in einem Umfang gegen Austausch geschützt, der dem in einem kompakten, aber teilweise fehlgeordneten Zustand entspricht, den man als molten globule (geschmolzenes Kügelchen) bezeichnet. Neue massenspektrometrische Methoden, mit denen sich die gefalteten Bereiche lokalisieren lassen, werden gerade entwickelt.

Zu jedem ordentlichen Faß gehört freilich auch ein Deckel. Als solcher fungiert beim Cpn-60 das kleinere, aus sieben Untereinheiten aufgebaute Co-Chaperonin Cpn-10. Seine Funktion ist allerdings umstritten. Immerhin steht fest, daß manche Substrate nach der Faltung nur in Anwesenheit von Cpn-10 wieder freikommen. Nach Untersuchungen von Johannes Buchner an der Universität Regensburg und George Lorimer bei der Firma DuPont in Wilmington (Delaware) sind das all jene, die sich unter den gegebenen Reaktionsbedingungen ohne Hilfe der Anstandsdame nicht korrekt falten könnten.

Meist dockt nur ein Cpn-10 an einer der beiden Öffnungen des faßartigen Gebildes an. Unter gewissen Bedingungen setzt sich jedoch ein zweites auf die Gegenseite und ergänzt den Komplex zu einem Ellipsoid, das einem Rugbyball ähnelt. Zur Zeit herrscht Uneinigkeit darüber, ob dieser Komplex aus Faß und zwei Deckeln für die Funktion der Anstandsdame von Bedeutung ist. Klarheit darüber ist schwer zu erlangen, weil Bindungsgleichgewichte empfindlich von Ionenkonzentrationen abhängen, die man in der lebenden Zelle nicht genau genug bestimmen kann.

Nachdem es gelungen ist, die Kristallstruktur des ligandenfreien Chaperon-Proteins zu ermitteln, und auch für den Komplex aus Cpn-60 und ATP die Röntgenstrukturanalyse kurz vor dem Abschluß steht, dürften wir schon bald mehr darüber erfahren, was denn genau Cpn-60 mit seinen Substraten anstellt. Außerdem wächst das Arsenal biochemischer und biophysikalischer Methoden, die teils speziell für dieses vertrackte Problem entwickelt wurden. Deshalb sollte das Rätsel noch bis zum Jahre 2000 zu lösen sein – notfalls wiederum mit etwas Nachhilfe Fortunas.


Aus: Spektrum der Wissenschaft 4 / 1995, Seite 16
© Spektrum der Wissenschaft Verlagsgesellschaft mbH

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